富磷生物(PAOs)会是富糖生物（GAOs）吗?外文翻译资料

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富磷生物(PAOs)会是富糖生物（GAOs）吗?

Yan Zhou, Maite Pijuan, Raymond J. Zeng, Huabing Lu, Zhiguo Yuan*

昆士兰大学高级水资源管理中心(AWMC)，布里斯班QLD 4072，圣卢西亚，澳大利亚

文章历史：2007年10月9日收到投稿；

2007年12月27日收到经修订后的投稿；

2008年1月1日正式接受；

可于2008年1月5日在网上下载。

摘要：已知聚磷酸盐(poly-P)是富磷微生物(PAOs)代谢的关键化合物。在本研究中，我们使用一种高富集度(80%)的磷伏隔菌(下文简称PAO)污泥，研究这些微生物在多磷限制条件下厌氧利用醋酸盐的能力。生物量经历了多次厌氧和好氧循环，在此过程中，富磷微生物的聚磷酸盐池逐渐清空，供给磷酸盐不足的饲料，在每个厌氧周期结束时用不含磷的培养基洗涤生物量。三次循环后，磷基本不释放，但富磷微生物仍能吸附乙酸盐，并以聚羟基烷酸盐(PHA)的形式储存，post-FISH化学染色后可见。糖原降解显著增加，说明富磷微生物以糖原为主要能量来源。这是聚糖生物(聚糖生物)的一个关键特征，已知聚糖生物在增强生物除磷(EBPR)系统中与富磷微生物竞争。乙酸盐的摄取、多羟基丁酸盐(PHB)和多羟基戊酸盐(PHV)的产生、糖原的消耗与之前提出的聚糖生物厌氧模型吻合较好。

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关键词：磷酸酯；强化生物除磷（EBPR）；富磷微生物(PAO)；聚糖生物（GAO）；多聚磷酸盐；糖原

1. 介绍

生物除磷(EBPR)是通过交替厌氧和好氧条件回收富磷微生物(PAOs)来实现的。富磷微生物在厌氧阶段吸收碳源，主要是挥发性脂肪酸(VFAs)，并以多羟基烷酸(PHAs)的形式储存。所需的能量主要来自细胞内多磷酸盐(poly-P)的降解，多磷酸盐作为正磷酸盐释放到液体中。在随后的好氧阶段，富磷微生物利用已储存的聚羟基烷酸盐作为能量来源，利用正磷酸盐恢复聚磷水平。糖原也被发现是PAO代谢的关键成分(Liu et al，1994;Maurer et al，1997)。它在厌氧期间被消耗，以提供从VFAs合成PHAs所需的还原能力(Mino et al，1987)。这个过程还会产生额外的能量，这被认为是富磷微生物吸收并转化为PHAs所使用的能量的补充来源。糖原在随后的好氧阶段以厌氧合成的PHAs为碳源和再生能源。

直到20世纪90年代初，人们认为富磷微生物是在厌氧条件下能够吸收碳源的独特生物，使其在EBPR系统中相对于其他生物获得竞争优势(Matsuo et al， 1992)。后来的研究表明，另一种功能类群生物，即所谓的聚糖微生物(GAOs)，也能够厌氧地储存碳源(Liu et al.， 1996)。这些微生物不进行厌氧磷释放和好氧磷吸收，因此不从废水中去除磷。然而，它们在交替的厌氧和好氧条件下以类似于富磷微生物的方式转化碳。主要区别在于，聚糖积累生物将糖原作为厌氧VFA摄取的唯一或主要能量来源，在厌氧和好氧条件下分别消耗和再生更多的糖原。在厌氧条件下，聚糖积累生物通过糖酵解来降解储存的糖原，为VFA的吸收提供能量，为PHAs的合成提供还原能量(Liu et al.， 1994)。在有氧条件下，聚糖积累生物氧化厌氧合成的PHAs，为细胞生长和糖原补充提供能量。因此，聚糖积累生物在EBPR系统中不需要磷的释放和吸收就可以生存和生长。

糖原的利用和再生是PAO代谢的重要组成部分（Schuler Jenkins，2003) 。假设聚糖代谢(GAM)最有可能是富磷微生物在磷限制条件下产生能量的主导过程，尽管该研究没有提供证据。本研究旨在通过实验阐明富磷微生物在细胞内多聚p缺失或低存在时的代谢情况。本研究采用实验室规模培养的磷化伏隔杆菌(以下简称PAO)进行，EBPR和高富集(约80%)，未检测到已知的聚糖积累生物。生物量的多聚磷池是通过去除所有通过生物量洗涤厌氧释放的磷而耗尽的，然后将生物量置于随后的好氧时期。这个过程重复了几个连续的周期，直到被检测到的厌氧磷释放可以忽略不计。然后研究了在没有多聚磷池的情况下培养基进行的碳转化。

1. 材料和方法

2.1用于浓缩富磷微生物的反应器操作

以含VFAs和正磷酸盐的合成废水为原料，采用SBR反应器对富磷微生物进行富集。反应器的工作容积为8L，循环时间为6h，其中厌氧130min、好氧160min、沉降换瓶65min、厌氧空转5min。在每个循环中，厌氧周期的前6min，将2L合成废水送入反应器，水力滞留时间(HRT)为24 h。好氧周期结束时耗费250mL混合液，固相滞留时间(SRT)为8天;pH值在8以下厌氧和好氧期间均由单向控制器通过0.5 M HCl的剂量进行控制。整个周期pH值变化范围在7.0-8.0之间。合成饲料中唯一的碳源在乙酸酯和丙酸酯之间交替，切换频率为2周，为富磷微生物提供优于聚糖积累生物的选择性优势(Lu et al.， 2006)。饲料中化学需氧量(COD)与磷的比值为15 (g COD/g P)，反应器运行的更多细节见Lu等(2006)。当生物质被提取时，SBR被喂食醋酸盐，进行下面报道的实验。

2.2实验设计

在好氧期结束时从SBR中抽出三升污泥，浓度为1.9 g VSS/L，转移到3.1 L间歇反应器中，曝气15分钟后，实验开始。试验包括5个厌氧/好氧循环，详见表1。周期1和2的目的是消耗细菌细胞中的多聚磷含量。第3和第4个周期的目的是研究富磷微生物在无氧条件下吸收VFAs的能力。第4和第5个周期的目的是研究在污泥中重新引入磷后，富磷微生物对磷的释放和吸收的恢复情况。每个循环包括2小时的厌氧阶段、人工沉降、换瓶和洗涤阶段以及3小时的好氧阶段。在每个厌氧期开始时加入浓缩醋酸盐，得到初始醋酸盐浓度如表1所示。在每个厌氧期结束时，生物量被允许沉淀，上清液被倒出。然后在下一次好氧周期开始之前，用母本SBR(不含磷酸盐或COD)的废水对生物量进行两次洗涤。采用这种方法是为了去除厌氧期间释放的磷酸盐和任何残留的醋酸盐。

通过间歇反应器的顶空喷射氮气，确保厌氧阶段的厌氧条件。在整个实验过程中，通过加入1 M HCl或0.4 M NaOH将pH控制在7.5plusmn;0.01。

在厌氧阶段的第一个小时的每15分钟和厌氧阶段的最后一个小时的每隔30分钟，加30毫升混合酒样品且第一个小时的有氧运动阶段和最后2 h有氧期间的每60分钟分别为分析聚羟基烷酸盐的糖原,混合酒悬浮物(mls)和混合酒挥发性悬浮固体(MLVSS)。样品立即用甲醛固定，停止反应，然后用磷缓冲液(PBS)洗涤，再低温冷冻。每隔一段时间取液相样品，用一次性使用的微孔过滤装置(0.22 mm孔径)立即过滤5mL混合液样品，用注射器进行醋酸盐、氨、亚硝酸盐、硝酸盐、磷酸盐的分析。上述分析所采用的分析方法将在单独一节中加以说明。通过对醋酸盐曲线线性部分的线性回归分析，确定了厌氧醋酸盐的体积吸收速率。生物质比乙酸盐吸收速率是用体积乙酸盐吸收速率(上述测定)除以生物质浓度来确定的。生物量浓度是通过从VSS浓度中减去聚羟基烷酸盐和糖原浓度得到的，这是许多其他研究人员以前使用的方法(见Hesselmann et al. 2000;曾等，2003)。

在每个循环的厌氧和好氧阶段结束时，取生物质样品，用半形式醛固定，进行原位荧光杂交(FISH)和聚羟基烷酸盐染色，具体方法单独切片。

以上实验重复两次。

a.表中醋酸盐浓度为添加后厌氧期开始时的浓度。

b.循环4中的磷酸盐浓度为添加后好氧期开始时的浓度。

c. 循环5中的磷酸盐浓度为添加后好氧周期最后一小时的浓度。

• 1. 分析

氨(N-NH4 )、硝酸盐(N-NO3-)、亚硝酸盐(N-NO2)和磷酸盐(P-PO4/3)的浓度采用Lachat QuikChem8000流动注射分析仪(Lachat Instrument, Milwaukee, Wisconsin)进行分析。VFAs采用Perkin-Elmer气相色谱(GC)，柱DB-FFAP 15m 0.53mm 1.0 mm(长ID膜)，1401c测定。按照标准方法(A, 1995)对MLSS和MLVSS进行分析。

用Zeng et al.(2003)方法测定糖原。将5mL 0.6 M HCl加入拧盖玻璃管称量的冻干生物质中，105摄氏度加热6 h，冷却离心后，将1mL上清移入高效液相色谱瓶中进行葡萄糖分析。采用(Oehmen et al，2005a)方法对聚羟基烷酸盐进行分析，以确定聚-b-羟基丁酸酯(PHB)、聚-b羟基戊酸酯(PHV)和聚-b-羟基-2-甲基戊酸酯(PH2MV)。将称重后的冻干生物量和PHB/V、PH2MV标准放入螺旋盖玻璃管中。将试管置于3% H2SO4和2mL氯仿酸化的2mL甲醇中，100 1C加热20 h。冷却后加入1mL ml - q水，混合样品。当相分离时，将底层有机层约1mL转移到GC瓶中进行分析。

FISH进行如(Amann，1995)与所述Cy5-labelled EUBMIX探针所有细菌(Dyne et al .,1999),Cy3-labelled PAOMIX探针(Accumulibacter,com撬等量的探针PAO462,PAO651,和PAO846 Crocetti et al .,2000),Cy3-labelled GAOMIX探针(为Candidatus Competibacter phos聚羟基烷酸盐或Competibacter,一个已知的高,由等量的探针GAOQ431 GAOQ989,Crocetti et al .,2002),cy3标记的DF1MIX(用于Defluviicoccus vanus cluster 1-related 聚糖积累生物，或Dv聚糖积累生物 comprising等量的探针DEF218和DEF618, Wong et al.， 2004)和cy3标记的DF2MIX(用于D. vanus cluster 2-related 聚糖积累生物，包括等量的探针DF988和DF1020加上辅助探针H966和H1038, (Meyer et al.，2006)。采用蔡司LSM 510元共聚焦激光扫描显微镜(Meta confocal laser-scanning显微镜，CLSM)观察鱼制剂，使用Plan Apochromat 63 oil (NA1.4)物镜;每个样本取30张图像进行量化，如(Zhou et al. ，2007)所述。将含有cy3标记细胞的区域量化为每张图像中cy5标记细胞面积的百分比。最后的量化结果表示为从30幅图像中得到的平均百分比，并分析一个标准误差。均值的标准误差(SEmean)计算为面积百分比除以分析图像数量的平方根的标准差。

胞内聚羟基烷酸盐染色采用Ostle和Holt(1982)方法。随后，用蒸馏水清洗FISH分析的显微镜载玻片上的生物量，并用1%的尼罗蓝溶液(Sigma-Aldrich)在55 1C下染色10min。用蒸馏水冲洗载玻片，然后用8%的醋酸水溶液快速冲洗载玻片，再用蒸馏水冲洗载玻片，用盖玻片固定在蒸馏水中。尼罗蓝A染色的聚羟基烷酸盐分别在362 nm和460 nm处具有最大的激发和发射。使用Cy3设置再次定位和在CLSM上成像FISH显示的字段。利用FISH获得的图像进行生物鉴定，利用尼罗蓝A图像确定细胞内聚羟基烷酸盐细胞。

1. 结果与讨论

3.1反应器性能及微生物群落

SBR在稳定状态下工作，在批量实验时表现出良好的EBPR性能。图1为批量实验前SBR加醋酸盐的循环研究结果。PAO表型清晰显示。厌氧期间，醋酸盐在30min内完全吸收，P释放(P-mol/C-mol比0.6)，聚羟基烷酸盐积累，糖原降解。在好氧阶段，磷吸收、聚羟基烷酸盐利用和糖原补充同时进行。本循环研究得到的实验化学计量如表2所示。(Yagci et al. ，2003)基于富磷微生物和聚糖积累生物混合培养对醋酸盐吸收的代谢模型，提出了一种利用碳转化数据估算厌氧PAO和GAO活性的方法。该方法估计富磷微生物吸收99%的醋酸盐，而GAO的作用几乎可以忽略(1%)。FISH的实验结果支持了这一观点，结果显示所有已知的聚糖积累生物在污泥中都是无法检测到的。FISH的结果还显示，一种被广泛报道的PAO，即伏隔核杆菌，在污泥中富集(8070.3%的细菌)。考虑到估计的非常低的GAO活性(1%)，我们假设剩余的细菌种群可能是其他富磷微生物，它们不与PAOMIX探针结合，或者是侧翼细菌，这些细菌是利用富磷微生物和聚糖积累生物的裂解物在SBR中生长的。

3.2醋酸盐吸收，P释放可忽略

在五周批处理测试中，醋酸盐和磷酸盐的分布情况如图2所示。在第一个厌氧期，加入acet酸盐，353mgCOD/L，同时释放255mg P-PO4 3 /L。P释放量与醋酸盐吸收比为0.7 P-mol/C-mol，与反应器正常运行时的比例相当。在沉降、换瓶和洗涤阶段，除去释放的磷酸盐和残留的乙酸盐。在接下来的好氧阶段，由于采用了从母反应器出水制备的无磷培养基作为孵育液，多聚磷池无法再生。在第二周期中，加入的300mgCOD/L醋酸盐中，有232mgCOD/L被吸收，同时

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