八个脱氮反应器中厌氧氨氧化细菌的鉴定与定量研究外文翻译资料

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八个脱氮反应器中厌氧氨氧化细菌的鉴定与定量研究

摘 要

各种研究表明，厌氧氨氧化（ anammox）是一种非常有吸引力的适合废水脱氮替代工艺。在这里，我们研究了在八个不同的脱氮反应器中的厌氧氨氧化细菌。通过16S rRNA基因分析，与特定探针的荧光原位杂交和实时定量PCR(qPCR)确定了厌氧氨氧化细菌的多样性和丰富度。在这些反应器中，至少检测到八个独特的近全长厌氧氨氧化16S rRNA基因序列，它们分布在两个属上：Candidati Brocadia和Kuenenia。FISH结果证实，在本研究中调查的八个反应器中，每个反应器中只有一个厌氧氨氧化细菌占主导地位。qPCR分析显示，厌氧氨氧化细菌存在于七个反应器中,A1反应器中大约有个细胞/ ml 和个细胞/ ml 。在一个反应器中，具有显性和发散性的溴代类厌氧氨氧化系统型代表了一个新的我们建议将其命名为Candidatas Brocadia sinica的物种。综上所述，这些结果表明，一个单一的接种污泥可以用来接种被设计处理不同类型的废水的厌氧氨氧化反应器，从而加快生物反应器的启动速度。

关键词：厌氧氨氧化菌多样性、多样性、脱氮反应器、Candidatus Brocadia

引言

在缺氧条件下，以亚硝酸盐为电子受体的厌氧氨氧化细菌将氨直接转化为氮气。自从20世纪中期它的发现(Mulder et al.,1995)以来，厌氧氨氧化工艺已被认为是一种经济高效且环保的处理含氨量高的废水的方法(Jetten et al.,1997) 。通过使用厌氧氨氧化工艺，运营成本和温室气体排放可以分别减少60% (不需要外部COD,更少的曝气和更低的污泥产生)，减少90% (消耗和无排放) (Kartal et al.，2010)。通过将厌氧氨氧菌巧妙地应用于市政处理，废水处理厂可以从耗能的系统转换为产生能量的系统(Kartal et al.,2010)。

厌氧菌的相对较高倍增时间(11－20天)被认为是该工艺成功应用于废水处理的主要瓶颈。然而，在过去的十年中，这一问题在实验室和全规模反应器系统中通过能够非常有效地保留污泥的配置都得到了解决:序批式反应器(SBR) (Hu et al.，2006; Strous et al.，1998; Kartal et al.，2008，)，旋转生物接触器(RBC) (Pynaert et al.，2003，)，滴滤器(Schmid et al.，2000)，UBF反应器(Jin et al.，2008)。颗粒污泥床反应器(Zheng et al.，2004) 和膜生物反应器(van der Staret et al.，2007; Trigo et al.，2006)。同时，在鹿特丹(荷兰)启动第一个全规模厌氧氨化反应器后,可利用的生物量将足以接种新的全规模能够大大减少启动时间厌氧氨化反应器，如果一种接种污泥源可用于处理不同类型废水的生物反应器(van der Staret et al.，2008; Abma et al.，2010)。

当使用分子技术(PCR，clone libraries，FISH) 研究实验室反应器和大规模反应器的生物量时，似乎厌氧氨氧化过程是由一组细菌介导的。全部五个在许多不同的废水处理系统中都检测到了描述的厌氧菌属( CandidatusBrocadia,Kuenenia，Scal indua,Anammoxoglobus, Jettenia) (Strous et al.，1999; Schmid et al.，2000，2003: Kartal et al.，2007， 2008; Quanet al.，2008) ;然而，在北极到热带地区的海洋生态系统中，只有一个属(Candidatus Scalindua) 普遍存在(Kuypers et al.，2005;Schmid et al.，2007; Penton et al.，2006)。

接种污泥，进水废水的种类和温度已被认为是控制厌氧氨氧化反应器中群落组成的重要因素(van de Vossenberg et al.，2008; Kartal et al.，2008; Zhang et al.，2008; Chang et al.，2008)。Chen等， 2010a; Tang et al.，2010a) 。反应器规模，反应器类型和反应器寿命也可能影响主要厌氧氨氧化细菌种类的选择和厌氧氨氧化细菌的数量。充分了解接种污泥对不同厌氧氨氧化细菌物种富集的影响，对于加快厌氧氨氧化细菌生物反应器的启动至关重要。如果可以从一种污泥中富集几种不同的厌氧氨氧化细菌和/或适应相同的条件，将减轻反应器设计的限制。

为了提高我们对不同废水处理系统中厌氧氨氧化细菌的多样性和丰富度与脱氮负荷、反应器结构、污泥年龄和种子污泥来源的关系的认识，我们在八个不同规模的污水处理反应器中检查了厌氧氨氧化细菌。使用16S rRNA 基因克隆文库，FISH 和qPCR,研究了这8个废水处理系统中的多样性和丰富度,并与其他研究进行了比较。

2 材料与方法

2.1. 样品收集

这项研究中研究的污泥样品是从中国的八个脱氨反应器中收集的(Chenet al.，2010b; Ni et al.，2010; Tang et al.，2010b,2010，详情见表1)。

2.2. DNA提取

通过离心收集生物质(2ml) 。将细胞重悬于磷酸钠缓冲液中,并加入玻璃珠(0.3g，直径0.25 mm)通过打珠的方式破坏细胞 。如前所述(Kowalchuk et al.，2004)，然后进行DNA提取。然后将DNA悬浮在50 mL超纯水中，并在4℃下保持24 h,直到进一步分析为止。通过1%琼脂糖凝胶电泳评估DNA质量，并使用NanoDrop ND-1000 ( Isogen LifeScience 荷兰)测量浓度。

2.3. PCR和克隆

使用P1a46F (大肠杆菌46—63 位)正向和通用反向630R (大肠杆菌1529—1545 位)的引物组合扩增门氏菌(Planctomycetes phylum)成员的16S rRNA基因(表2. Schmid et al.，2003)。根据制造商的说明，使用T Easy克隆试剂盒(Promega, 荷兰)直接克隆PCR片段。分离质粒DNA,并使用Gene JETM Plasmid Miniprep 试剂盒(Fermentas，加拿大)纯化。用5UECORI酶在37℃的ECORI缓冲液中消化1.5h。通过琼脂糖(1%)凝胶电泳检查消化产物的插入片段是否具有预期的大小。利用M13正向和反向引物靶向与多克隆位点相邻的载体序列和Amx368F引物靶向插入，确定16S rRNA 基因片段的序列。对检索到的序列进行分析、修剪，并在可能的情况下将其组合成一致的序列。这些共识序列已提交至GenBank,登录号为: 6Q175277—86。

2.4. 系统发育分析

如先前所述(Schmid et al.，2003) 。使用ARB软件进行序列的系统发育分析和qPCR引物的设计。系统发育分析采用最大似然法、邻接法和最大简约法进行50%种序列分析。厌氧氨氧化簇中每个分支的引导值均为100%。

2.5. qPCR

采用靶向16Sr RNA基因的引物组（ Amx694FeAmx960R ）对厌氧氨氧化细菌进行定量（表2）。使用iCycler iQ5 热循环仪和实时检测系统(美国加利福尼亚州Bio-Rad)进行实时梯度PCR。使用克隆的斯图加特氏苦肠菌序列构建了DNA标准曲线。每个PCR混合物（25毫升）由12.5毫升2times;SYBR绿色PCR主混合物（Finnzymes，芬兰）、1毫升正向和反向引物（20 pmol/mL）和1毫升模板DNA（—份）组成。在MicroAmp optical 96孔反应板中进行PCR扩增和定量。PCR程序如下:在96℃变性3分钟，然后在96℃变性40分钟,在64℃变性1分钟，在72℃变性1分钟。熔解曲线分析显示在Tm=86.5℃处只有一个峰。没有观察到与引物二聚体假象相关的可检测峰，也末观察到其他非特异性PCR扩增产物。扩增效率在95%到105%之间(斜率为-3.30)，检出限对应于3.7times;靶拷贝(参见图1)。

为了确定标准曲线的DNA提取效率，在提取前确定斯图加特氏克氏菌细胞数(1.44 times;—2.98times;个细胞/ml)。根据Weinbauer等人的计算，该方案的DNA提取效率为55—65%。(2002) ，使用平均值60%。如先前所述进行阴性对照、PCR靶标效率和产物纯度的评估。(Ni et al.，2010)