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膜生物反应器：一种新型的厌氧细菌作为游离细胞生长的工具

摘 要

在膜生物反应器(MBR)中，厌氧氨氧化细菌在污泥停留时间(SRT)为12天的条件下快速生长。相对较短的SRT对厌氧氨氧化细菌而言，达到了前所未有的纯度，达到了97.6％。由于没有选择压力来沉降，并且没有专门的培养条件，导致悬浮液以游离细胞的形式生长，并且完全没有絮状物或颗粒。快速生长，钙和镁含量低以及可能存在酵母提取物和低剪切应力对于获得由游离厌氧氨氧化菌细胞组成的完全悬浮培养物至关重要。在培养过程中，观察到种群从“ Brocadia”念珠菌向“ Kuenenia stuttgartiensis”念珠菌转移。据推测，这种转移的原因是对“ Kuenenia”亚硝酸盐的亲和力更高。具有高纯度和高生产率的悬浮细菌使得MBR成为培养和研究厌氧氨氧化细菌的有前途的工具。

关键词：厌氧氨氧化;缺氧氨氧化;“Kuenenia stuttgartiensis”;“Brocadia”; 膜生物反应器MBR;培养方法;选择压力;浮游细胞

引言

缓慢生长的微生物的培养需要有效地保留生物量，并且主要取决于微生物形成生物膜或聚集体例如絮状物或颗粒。这些反应器的启动可能会因生物质积累不足而受到阻碍：在微生物缓慢生长的情况下，通过废水不断损失少量的生物质可能导致观察到的生物质倍增时间明显更长（Strous et al, 1998）。基于颗粒污泥的反应器设计（Nicolella et al, 2000）导致了紧凑的反应器，其结合了较短的水力停留时间（HRT）和长而稳定的固体停留时间（SRT）。使用硝化（Tanaka and Dunn, 1982），厌氧消化（(Lettinga et al., 1980），亚铁离子氧化（Ebrahimi et al, 2005）和除磷（De Kreukand Van Loosdrecht, 2004）等缓慢生长的生物的过程。所有这些都可以在具有高体积装载率的基于保留的反应器中在实验室规模以及完整规模上成功实现。这种反应器的典型例子是气升式反应器（Heijnen et al., 1990），序分批反应器（SBR, Irvine et al.,1977; Wilderer and McSwain, 2004），内循环反应器（Pereboom and Vereijken, 1994）和上流式厌氧污泥床反应器（UASB, Lettinga et al., 1980;McHugh et al, 2004）。

尽管基于颗粒的生物反应器对于缓慢生长的微生物的培养是有利的，因此从技术角度来看是有价值的，但是所产生的颗粒不是用于研究这些微生物的最合适形式。由于絮凝物或颗粒本身内部的扩散限制，无法很好地评估生物动力学参数，例如底物亲和力，最大生长速率或维持需要（Chuetal, 2003; Harremoёs,1977）。为了获得用于多个微生物测试的单个细胞而执行的破坏程序（例如，最可能的数（MPN）方法和荧光原位杂交（FISH））需要大量的生物量，并且经常在获得的结果中引入偏差。最后，细菌凝聚所需的能量（例如，额外产生的细胞外聚合物）也可能降低观察到的最大比生长速率（）和结块，因此也有可能导致对的低估（Characklis，1990）。

在膜生物反应器（MBR）中，生物量的保留不是基于生物量的沉降。流出物通过微生物细胞不可渗透的膜排出。与具有颗粒状生物质的反应器不同，MBR可以培养具有完整生物质保留能力但无法选择沉降能力的缓慢生长的微生物。该反应器类型目前用于敏感细胞（如植物/动物细胞）的生长以及细胞组织的生产（Drioli and e Bartolo，2006）。MBR还用于大规模废水处理（Sutton，2006； Yang et al，2006），其中膜分离减少了沉降絮凝污泥通常所需的表面积。

在这项研究中，我们证明了在MBR中以高纯度和高生产率培养慢速厌氧菌细胞的可能性。厌氧氨氧化过程是将铵和亚硝酸盐生物转化为氮气的方法（Van de Graaf et al，1996），是通过缓慢生长深分支的扁平菌（Strous et al，1999a）进行的。厌氧氨氧化细菌是自养的，并且生长速度极低，几天的最小倍增时间最少（Strous et al，1998； Tsushima et al，2007）。尽管对它们的培养有相当大的兴趣，但只能得到由附聚物或生物膜组成的浓缩物（通常含有60％至80％的厌氧细菌）。这甚至可能导致人们认为厌氧氨氧化细菌优先在生物膜或颗粒中生长。这种看法通过（有效的）观察结果得到了加强，即选择颗粒污泥或生物膜反应器中的生物膜通常可以通过更好的生物质保留来改善（Strous et al，1998）。然而，在几种海洋系统中，高氧厌氧菌在厌氧-缺氧界面上的丰度很高（Schmid et al，2007），表明游离细胞的生长也是一种自然的生长方式。

厌氧氨氧化工艺已在基于生物膜的生物反应器中全面应用（Rosenwinkel and Cornelius，2004； Van der Star et al，2007）。与厌氧菌生物研究中与这些反应器相关的问题相反，对于厌氧菌法在脱氮中的应用，这些类型的反应器优于MBR，由于厌氧氨氧化细菌很容易形成污泥颗粒或生物膜，这是在反应器中获得高生物量浓度的一种简单而经济的方法。而且，废水总是含有一定量的悬浮固体。由于这些固体也被膜过滤保留，并且由于厌氧细菌的自养性质，其厌氧菌的生物量相对较低，因此在基于MBR的全规模厌氧菌中污泥活性也有望迅速降低。

在这项研究中，据报道，大规模的MBR中缓慢生长的厌氧细菌成功富集到高纯度，成为单细胞。完全悬浮的厌氧细菌产生的高产量在超过9个月的时间内，该反应器成为研究厌氧氨氧化工艺的有前途的工具。

材料和方法

2.1接种MBR

在荷兰鹿特丹Dokhaven-Sluisjesdijk废水处理厂，从全规模厌氧氨氧化反应器下部隔室底部接种了颗粒状厌氧氨氧化污泥（Van der Star et al，2007）。除去固体中最重（即沉降最快）的20％（具有高沉淀物含量）后，将反应器接种剩余的1.5 L颗粒状生物质。

2.2 反应器运行

使用15 L反应器进行培养（见图1）。液体体积为8 L，向反应器连续喂入3.9–4.1 L /天的不同组成的培养基，HRT为2天。通过连接到放置在反应器容器内的膜微滤模块Zeeweed（Zenon Environmental，Ontario，CA）的液位控制（蠕动）流出泵维持液位。膜纤维（绝对孔径：0.1毫米）设计用于在MBR中用于废水处理，并且对于微生物细胞是不可渗透的。所使用的实验室规模的模块（ZW1）包含约100个管（直径约1毫米，长度约300毫米）。每隔10天更换一次模块，以防止生物膜在膜表面生长，然后用含蛋白酶的洗涤剂（Tergazyme，Alconox，NY）清洗（反应器外部）。长时间清洁后，用水彻底冲洗，应小心清除所有洗涤剂。更换膜仅需1-2分钟，并在更换过程中停止混合，以免大量空气进入反应器。

为了维持缺氧条件并提供缓冲能力，将反应器以25 mL / min的速度连续喷射95％Ar-5％CO₂。pH值不受控制，但始终在7.1至7.5之间。将温度控制在388℃，搅拌速度为160rpm。为了避免光养生物的生长（以及相关的氧气产生，这将使其他非厌氧微生物如硝化细菌的生长），反应器被PVC覆盖层完全覆盖（厚度为1毫米），以防止光的渗透。根据Van de Graaf等人的方法，向反应器中加入浓缩介质。（1996）含有120mM铵和120mM亚硝酸盐（表I）。

启动阶段从第一周开始，在第一周中，饲料中应包含100 mM硝酸钠，以避免潜在的硫酸盐还原。从本周开始，进水的亚硝酸铵浓度从20 mM逐渐增加到120mm，分三步进行。然后，经过30天的完全生物量保留(几乎无限SRT)， SRT被控制在ca.16天，每天从反应器中除去0.5 L(30分钟内)，使用未连接到膜上的剩余污泥泵，但直接将反应器-悬浮体泵出。该剩余污泥泵的运行由计算机控制。这一天，当SRT开始被控制在16天，就是从这里开始指定第一天的实验。

图1. A：膜生物反应器（MBR）的照片，用于富集作为自由细胞的厌氧菌和污泥排出容器；MBR包含完全悬浮的红色厌氧菌细胞，它们也悬浮在（未混合！）污泥排出容器中。膜（B）完全浸入反应器中（B）所使用的膜组件的照片；MBR的（C）方案显示了膜，气体喷射器以及进水和出水管线的位置。

在第85天，在亚硝酸盐不完全转化的时刻之后，调节培养基组成。培养基中的钙和镁含量降低了75％，并且开始添加1mg / L的酵母提取物（表I中调节的培养基组成）。在第127天，SRT缩短为12天。此SRT还要再维持100天。从第150天起，将铵从120mM降低至100mM以减少反应器中过量的铵。该反应器运行超过250天。

2.3亚硝酸盐，硝酸盐，铵，一氧化二氮和一氧化氮的测定

使用商业化的Dr.Lange测试分析了铵（0.14–3.4 mM），亚硝酸盐（1.1–43 mM），硝酸盐（16–964 mM）。

表I.用于富集厌氧菌生物体的不同培养基组成。

括号中的值为mM。

此值从第70天起降低至1,400 mg-N / L（100 mM）。

试剂盒（(Hach Lange GmbH, Duuml;sseldorf, Germany）并在指定的分光光度计（CADAS 50S）上测定。每20分钟将废气收集到1 L的样品袋中，并用化学发光分析仪（CLD700e，Eurphysics，Durnten，Switzerland）从该袋中测定一氧化氮（NO）。有时通过气相色谱法确定N₂O：将100 mL废气样品直接注入Varian 3800气相色谱仪（Varian, Palo Alto, CA）上的Hayesep Q 80/100 Ultimetal微填充柱（0.25 mx 1/1600x 1 mm）。在电子捕获检测器中确定的N₂O的下限约为ca.2 ppm。

2.4使用分子方法进行社区分析

2.4.1荧光原位杂交 剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

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