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水研究
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比较10个全尺寸膜生物反应器中活性污泥和生物膜的微生物群落
Sung Jun Joa , Hyeokpil Kwon a , So-Yeon Jeong b , Chung-Hak Lee a , * , Tae Gwan Kim b , **
首尔国立大学化学与生物工程学院，首尔08826，韩国
釜山国立大学微生物系，釜山46241，韩国
文章信息
文章历史：
于2016年2月28日收到初稿
于2016年5月4日收到修改稿
于2016年5月13日采纳
于2016年5月27日在网站发布
关键词：
膜生物反应器
生物淤积
微生物群落
微生物网络
摘要
用于污水处理的膜生物反应器（MBRs）的运行受到微生物活动引起的膜生物污损的阻碍，然而，关于MBR中生物膜和活性污泥的微生物生态学的知识还不够完善。在这项研究中，我们仔细检查了10个全尺寸MBR装置中的生物膜和活性污泥的微生物群落。总的来说，Flavobacterium, Dechloromonas和Nitrospira在生物膜中是丰富的，而Dechloromonas, Flavobacterium和Haliscomenobacter在活性污泥中是丰富的。我们对生物膜或活性污泥中的群落结构进行了分析。不出所料，在MBR中，不仅微生物群落具有多样性，而且其组成彼此不同（p lt;0.05）。在生物膜和活性污泥之间，群落组成有显着差异，但其多样性程度（即，多样性，如丰度，多样性和均匀度）并没有（pgt; 0.05）。经过使用Spearman相关性研究10个环境因素对群落变化的影响后发现，MLSS，HRT，F / M比和SADm表明了生物膜中微生物组成的变化，而在活性污泥中只有MLSS有此作用。微生物网络由10个环境因素构成。网络研究结果表明，生物膜和活性污泥网络之间存在不同的拓扑特征，4个因子中的每一个与微生物节点都具有不同的关联。这些结果表明，不同的微生物组合负责生物膜和活性污泥之间群落组成的变化。
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1.介绍
膜生物反应器（MBRs）将膜分离与生物化学转化结合在一起，导致了一系列创新的环境生物技术应用于废水处理和再利用（Hai等，2013）。生物淤积是MBR运行过程中的主要障碍之一（Meng等，2009），因为它导致装置生产率/渗透率，膜寿命和能源效率降低（Drews，2010）。活性污泥中膜污染物中微生物的产生和膜表面微生物的繁殖一样，都是生物污损的主要缘由（Malaeb等，2013）。然而，微生物生态学迄今尚未得到充分阐明。尤其是关于实际MBR中的生物膜和活性污泥的微生物系统，几乎没有公布的调查报告。
由于活性污泥是MBR中膜上生物膜的唯一接种物，生物膜中的微生物群落可能类似于活性污泥中的微生物群落。然而，许多研究报告了实验室和试验规模MBRs中活性污泥和生物膜中微生物群落的差异。例如，Piasecka等人（2012）发现，活性污泥中的细菌群落与实验室规模MBR初始阶段的生物膜（具有平片膜的18.6L反应器）不同。 Lim等 （2012）报道，在实验室规模的MBR（具有中空纤维膜的6L反应器）中，松散地附着于膜上的生物滤饼的微生物组成与活性污泥的微生物组成不同。这些差异主要从单膜生物反应器观察到，这意味着需要对多个MBR进行微生物观察以确定生物膜是否与活性污泥具有不同之处。
一般来说，环境因素可能会影响废水处理系统中的微生物群落。许多研究表明，各种运行参数（如曝气，营养物去除过程）对活性污泥中的微生物群落具有重要影响（Hu等，2012; Zhang等，2012; Zhao等，2014 ）。然而，只有少数研究报道了环境因素（例如，膜的不同特征）对生物膜微生物群落的影响。例如，Lee等 （2014）发现聚醚砜（PES），聚四氟乙烯（PTFE）和相同孔径的PVDF在生物膜方面存在差异。
最近，网络分析已被应用于更好地了解废水处理系统内复杂的微生物群落（Fuhrman，2009; Faust和Raes，2012）。网络分析提供了对复杂微生物群落结构的新见解（Barberan等，2012; Williams等，2014）。例如，Kim等人（2015年）在生物甲烷生产系统中报道了包含环境因素的细菌和古细菌微生物网络，发现细菌和古细菌之间的能量生产的关键相互作用。本研究的主要目标是阐明生物膜和活性污泥的微生物复合性，并确定环境因素对全尺寸MBRs中生物膜和活性污泥中微生物群落的影响。我们使用高通量测序技术（Illumina MiSeq平台）对10种具有不同膜材料，营养物去除过程和运行参数的全尺寸MBR进行了调查。
2.材料和方法
2.1.采样地点和方法
10个MBR的特性和具体过程如表1，表S1和S2所示。提供了环境因素（流量，流量，F / M比，膜槽尺寸，容器通气率，总膜面积，膜材料，SRT，BOD，COD，TN，TP和操作模式）由操作员在每个MBR中。本研究采用高锰酸钾（KMnO4）测定COD。因为这种方法只能衡量有机质的一部分（Henze，2008），大部分BOD值都大于COD值。基于膜池曝气和总膜面积计算SADm。基于膜槽的流量和尺寸计算膜箱中的HRT。通过标准方法一式三份测量膜池中MLSS的浓度（APHA等人，2005）。使用数字温度计（中心科技公司，台湾中心309号）测量膜箱中的温度三次。
用起重机将膜箱中的膜组件从膜槽中取出，用自来水轻轻冲洗具有生物膜（跨膜压力gt; 20kPa）的膜表面，以从活性污泥中除去碎屑和过量的细胞。使用灭菌纱布将生物膜从膜表面分离，并将其保存在灭菌的锥形管（50ml）中。在膜组件的中间部分，随机选择膜组件中三个生物膜取样点（一式三份）。从膜箱中的三个采样点收集活性污泥样品。将活性污泥取样到50ml灭菌的锥形管中。
2.2.DNA提取，PCR扩增和Miseq平台测序
如下制备样品进行DNA提取。将一片带有生物薄膜的纱布（1厘米times;1厘米）切成小块。通过离心（10,000g，1分钟，25℃）浓缩1.5ml活性污泥，并将沉淀重新悬浮在0.5ml蒸馏水中。将这些样品放入珠管中进行DNA提取。使用NucleoSpin土壤试剂盒（Macherey-Nagel GmbH，Duuml;ren，Germany）从沉淀物中提取DNA。将DNA在100ml洗脱缓冲液中洗脱。使用ND-1000分光光度计（NanoDrop Inc.，Wilmington，DE，USA）定量洗脱的DNA。
为了确定微生物群落，进行了部分16S核糖体RNA基因的Illumina MiSeq平台测序技术。根据Illumina公司16s宏基因组测序文库制备（Illumina，San Diego，USA）的方案制备每个测序的样品。通过PicoGreen和NanoDrop测量DNA的定量和DNA质量。16S rRNA基因用引物341F扩增
（50 -CCTACGGGNGGCWGCAG-30）和
785R（50-GACTACHVGGG-TATCTAATCC-30）。这些区域（V3eV4）选自Klindworth等人（2012）。将Illumina接头突出核苷酸序列加入到基因特异性序列中。
使用引物扩增输入gDNA（12.5ng），并进行后续的有限循环扩增步骤以添加多重指数和Illumina测序接头。使用PicoGreen对最终产品进行归一化和合并，并使用LabChip GX HT DNA高灵敏度试剂盒（PerkinElmer，Massachusetts，USA）验证文库的大小。然后，Macrogen Incorporation（韩国首尔）使用MiSeqtrade;平台（Illumina，San Diego，USA）进行测序。
2.3.细菌群落的数据分析
使用Mothur版本1.35.1（Schloss等人，2009）修剪和分析测序数据。使用Miseq的标准操作程序筛选序列（Kozich等，2013）。细菌文库的平均核苷酸长度为454bp。使用具有丰富序列的Uchime函数作为参考，去除嵌合序列。所有序列均使用SILVA参考文库进行分类。在本研究中获得的测序读数存入日本DNA数据库（DDBJ）序列红档案（http：// trace。ddbj.nig.ac.jp/dra）。 DRA004059。对于群落分析，运营分类单位（OTU）以3％的不相似性确定。使用Mothur软件进行系统分析。每个解码在属级别进行分类学分配，引导值超过80％，从门到门的分类学分类。在清洁原始读数后，共获得了1,982,648个有效序列。群落多样性度量（即多样性，均匀性和丰富度）通过1000次迭代从原始序列文库（修剪后为18,066-52,075个序列/样本）的1000个序列进行随机重采样来估计。使用FigTree软件版本1.4.2（http://tree.bio.ed.ac.uk）可视化微生物群落群。使用Mothur软件进行主坐标分析（PCoA）。对于聚类分析和PCoA，通过1000次迭代的1000个序列的随机重采样来计算Yue＆Clayton相似性。
2.4.网络分析
使用基于Spearman相关的网络分析来揭示10个全尺寸MBR中生物膜细菌群落的膜表面和活性污泥的共生模式。使用扩展局部相似性分析（eLSA软件）检查Spearman相关性（Xia等，2011）。在生物膜和活性污泥的所有样品中只选择平均相对丰度为0.2％的细菌OTU。分析包括每个样品的细菌OTU的相对丰度和10个环境因素，即膜槽中的MLSS，膜池中的HRT，F / M比，SADm，膜池中的平均温度，BOD，COD ，TN和TP。微生物关联是从斯派尔曼相关系数可视化的（连接代表强烈的斯派曼氏rgt; 0.75和负的斯派曼氏r lt;0.75），并使用Cytoscape 3.2.1版（Shannon等，2003）确定其p值。排除了与p ge;0.05无关的无关联（边缘）。网络拓扑特征使用网络分析仪工具（Assenov等，2008）进行计算。
2.5.统计分析
使用完全随机区块设计（块状，MBR和处理，生物膜和活性污泥）来分析多样性度量（丰度，多样性和均匀度）的变化。多样性测度与10个环境因子之间的矛盾相关性被用于识别每个环境因素的影响。此外，还检验了主坐标分析（PCoA）轴1和环境因子的值之间的关系。本研究认为Spearman相关系数的绝对值大于0.5（p lt;0.05）。 Tukey-Kramer试验用于分析膜材料（PE，PTFE，PVDF和c-PVC）对生物膜细菌组成的影响（图3（a）中PCoA轴1的值）。 PE，PTFE，PVDF和c-PVC的样品分别为15,3,3和9。使用Hmisc包进行RCBD和Spearman相关性，并使用R环境中的DTK包（www.r-project.org）进行Tukey-Kramer测试。
2.6.计算法定感染相关细菌的相对比例
群体感知（QS）相关细菌被文献调查列表分类（表S3）。具有完整的群体感应系统的细菌属包括负责N-酰基 - 高丝氨酸内酯（AHL），自动诱导肽（AIP）或自动诱导剂-2（AI-2）的生产和接收的基因。使用系统型分析的结果计算QS相关细菌在属水平上的相对比例。
表格1
10种不同膜生物反应器的特点。
缩写：F / M比：食物与微生物的比例，FS：平板，HF；空心纤维，HRT：液压保留时间，I：工业废水，M：市政废水，MLSS：混合液悬浮固体，PE：聚乙烯，聚四氟乙烯，PVDF：聚偏二氟乙烯，c-PVC：氯化聚氯乙烯，SADm：对膜的特定曝气需求。
星号表示基于曝气池计算F / M比。
图1.生物膜和活性污泥中微生物群落的丰度（a），多样性（b）和均匀度（c）（n = 3）。
3.结果与讨论
3.1.群落多样性
Chao1丰富度估计，香农多样性指数和不均匀度估计为3％的序列差异（图1）。统计分析（RCBD）显示MBR之间的群落多样性度量（丰富度，多样性和均匀性）不同（表S4，p lt;0.05），生物膜和活性污泥之间没有差异。这一结果表明，MBR之间的差异不同，生物膜群落多样性与每个MBR中的活性污泥相似。该结果与先前对单一MBR的观察结果不同，揭示了生物膜和活性污泥之间的差异（Gao等，2014）。据推测，在生长性质方面，反应器和膜上的微生物生长可能并不是不同的，即絮状物和生物膜都是微生物聚集的结果（Laspidou和Rittmann，2002; Sheng等，2010）。此外，多样性与10个环境因素（例如，膜池中的MLSS，膜池中的HRT，F / M比，SADm，膜池平均温度，BOD，COD，TN和TP）可以使用Spearman相关性来确定（表S5）。只有温度（13.1-22.0℃）与Chao 1丰度显着相关（斯皮尔曼相关系数0.63，p lt;0.05），温度升高则群落数减少。一般来说，微生物可以通过最优生长温度来分类为嗜温菌，嗜酸菌和嗜热菌（Slonczewski和Foster，2013）。例如，精神病毒在温度范围0-20℃内生长，其最佳生长温度通常约为15℃。温度从13.1升至22.0 C可能会降低群落的丰富度，因为精神病患者在这个温度范围内可能会受到不利影响。 Leve n等 （2007）报道，不同的温度（37
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