使用细胞测量杨氏细胞模量的方法压缩微器件外文翻译资料

使用细胞测量杨氏细胞模量的方法压缩微器件

作者：横仓泰郎，中岛裕太，米本幸弘，彦吉，中西义孝

摘要：在许多生理过程中，细胞力学特性的重要性是显而易见的;因此，测量这些特性可以洞察人类疾病中细胞和组织的行为。在这里，我们描述了一种方法，评估细胞变形的细胞使用细胞压缩微设备。该方法包括两个步骤:1)利用微器件观察和评价压缩过程中细胞的变形行为;2)理论计算细胞的变形。我们通过将两层自粘聚二甲基硅氧烷堆叠在玻璃板上来构建这个微装置。第一层由微通道、细胞培养室和在培养室上用于向细胞施加压力的隔膜组成;第二层由单元式进气道和压力进气道组成。该微装置由透明材料制成，允许通过光学显微镜对细胞行为进行原位监测。这种微型装置被设计用来控制施加到细胞上的压力的大小。我们测量了细胞的压缩应变，以评估杨氏模量;测量值为3.5～4.2kPa。这些结果表明，我们的微装置可以用来测量和计算应变下细胞的力学性能。

关键词：细胞生物力学；细胞压缩微器件；杨氏细胞模量；细胞性质。

1. 介绍

细胞和组织的力学特性是其功能的基本方面。特别是，细胞刚度是细胞周期(Kelly et al.，2011)、细胞老化(Berdyyeva,Woodworth，amp; Sokolov,2005;Starodubtseva,2011)和分化(Pillarisetti et al.， 2011)。因此，测量机械性能可以洞察细胞和组织的行为。这些特性的重要性在人类疾病中也得到了证明;受癌症、疟疾和镰状细胞贫血影响的细胞表现出形状和硬度的改变(Brandauml;o et al.， 2003;Cross Sarah,Yu-sheng, Jianyu， amp; Gimzewski, 2007;Efremov等人，2014;Glenister, Coppel, Cowman, Mohandas，amp; Cooke, 2002年;Li,Lee,Ong， amp; Lim, 2008; Suresh et al，2005)。因此，细胞的力学特性可能被用作疾病的诊断标准。有几种方法可以测量细胞的力学性能，原子力显微镜(AFM)被广泛使用为此目的(Berdyyeva等人，2005;Cross Sarah等人，2007;Domke等人，2000年;Efremov等人，2014;Kelly等人，2011;

微通道SU-8结构 玻璃板

图 1.单元压缩微器件示意图，（a）微器件结构。 这些层通过PDMS的自粘性适当连接在一起。 （b）细胞培养室中细胞压缩的机制。 当通过压力入口口向细胞培养室上方的隔膜施加压力时，隔膜向玻璃板变形，直接压缩细胞。

李等， 2008;Pillarisetti et al.， 2011;西蒙等人， 2003; Takai， Costa， Shaheen，Hung， amp; Guo， 2005）。 AFM具有在近生理条件下测量活细胞的机械性能的能力。最近，AFM仪器已与光学显微镜集成，允许AFM尖端在特定区域上定位，并易于对区域拓扑进行成像（Richard Bowenamp;Hilal，2009）。

其他工具，如微量移液器（Glenister等人，2002年），光学镊子（Brandao等人，2003年;Cuvelier， Derenyi， Bassereau，amp; Nassoy，2005;Gerbal et aL， 2000;苏雷什等人， 2005;Svoboda， Schmidt， Branton， amp; Block， 1992）和磁珠（Bausch， Hellerer， Essler， Aepfelbacher，amp; Sackmann，2001;Deng， Fairbank， Cole， Fredberg， amp; Maksym， 2005;Zeng等人，2010）根据具体的实验要求并行使用。然而，这些仪器价格昂贵，对许多调查人员来说并不容易使用。

在本研究中，我们使用我们制造的细胞压缩微装置评估了细胞变形 （Nakashima，Yang，amp; Minami，2012）。 细胞压缩隔膜非常薄且柔软，因此，细胞压缩微德副可以对具有低侵入性的细胞施加压缩应力。该方法有两个步骤：使用微晶副观察和评估细胞变形，以及细胞变形的简单理论计算。在我们提出的方法中，我们通过估计细胞的杨氏模量并将我们的估计值与重新移植的值进行比较来评估细胞变形。

2.材料和方法

2.1 细胞共压微器件

细胞压缩微装置（图1）旨在控制施加在细胞上的压力大小，并能够实时观察细胞变形（Nakashima等人，2012）。该装置是通过三维微观结构制造工艺通过乘法暴露于SU-8光刻胶来构建的。该装置通过堆叠两层selamp;adhesive聚二甲基硅氧烷（PDMS;信越化学有限公司E = 3.2兆帕）（图（a）段）。第一层由微通道，细胞培养室和培养室上的di aphragm组成，用于-对细胞施加共压压力。第二层由电池入口和压力入口口组成。隔膜的变形量可以通过调节空气或静水压力来控制膜片。

2.2. 细胞变形的评估

通过观察细胞形状的变化来评估细胞变形。实验系统由细胞压缩微器件、压力传感器、微型注射器泵和倒置显微镜（ECLIPSE Ti-U;尼康，东京，日本）（图。MC3T3-E1成骨细胞作为靶细胞，在37°C下在95%加湿空气和5%CO？的气氛中，在a-Minimal Essential培养基中培养not;10%胎牛血清。使用0.25 w / v%胰蛋白酶-1 mmol / L EDTA溶液将C凝固细胞从培养瓶中分离出来（Wako Pure Chemical Industries，Ltd.）。通过微量移液管收集分离的细胞，并使用微型注射器泵将细胞从入口端口注入微滴冰的培养室中。然后，将微器件在37°C下保持在95%加湿空气和5%CO 2的气氛中一小时。随后，空气压力通过压力入口口供应到隔膜，并由出口端口上的传感器进行消除。放置在细胞培养室上的隔膜通过预先-确定的应用而变形;因此细胞被隔膜直接接触。通过调节气压来控制变形程度。电池和隔膜之间的第一个接触点被定义为参考点（图1）。

图2所示。观察和评价细胞变形行为的实验装置。压力出口端口上的压力传感器监测施加的压力。细胞形状被检测使用互补金属氧化物半导体(CMOS)相机连接到显微镜，并从捕获的图像进行测量。

图3所示。电池压缩微器件的尺寸。隔膜和电池之间的第一个接触点被定义为测量杨氏模量的参考点。

施加的压力从0.0 kPa增加到2.0 kPa，间隔为0.5 kPa。施加的压力值是 压力传感器值与初始值之间的差值。因此，我们认为压降没有显示出任何效果。使用连接到倒置显微镜的互补金属氧化物半导体相机压缩30秒后捕获细胞形状 。

杨氏成骨细胞模量是从变形的细胞形状和我们的简单分析模型中确定的，该模型假设细胞体变形 [图。 第4（a）段]。 在被隔膜压缩电池后，电池的球形形状变平，特别是在顶部和底部，它们与固体材料（即隔膜和玻璃板）接触。这在数学上如图所示 。 4（b）.在model中，细胞体的每一侧都被认为是一个半圆;扁平细胞的体积由 等式（1）表示：

Vo = 7tRr（2R jrr） -jrr³ （1）

图4所示。数学单元压缩模型的示意图表示。(a)细胞变形。细胞最初是球形的，随着压力的作用逐渐变平。(b)变形单元的详细示意图，用两个半径为r的圆表示。

式中，Vo为胞体体积，h、d、L、R根据方程相关。(2) -(4)。

h=2r (2)

L=d-h (3)

R== (4)

替换的方程式。(2)-(4)将式(1)转化为:

(5)

在我们的模型中，初始条件(R = 0)下，d = h，其中细胞体积表示为V0 =pi;/6。

那么，d是h的函数，说明h的变化直接影响d的变化，因此，假设杨氏模量是通过考虑高度方向变形速率的变化来估计的，如下所示。

(6)

其中εh = (h0-h)/h0。H0为胞体的原始高度，P、E分别为施加的压力和杨氏模量。在实验中，我们测量了施加的压力和电池宽度的变形率。单元宽度的变化率是根据定义来计算的: εd = (d0-d)/d0，其中d0为单元的原始直径，d为压缩后变形单元的直径，Delta;d为这两种直径的差值。

细胞的杨氏模量是由拟合理论的P值和εd 的实验值和通过E ε Eq。(6)的理论价值替换任意值计算的h (O lt; h lt; ho) Eq。(5)。因此, ε的理论价值是由εd的定义计算出来的，ε也由εh的定义计算出来。如果E有已知值，则的值由式(6)和计算的ε得到。然而，E实际上是一个未知的参数。这里，ε和的实验值来自2.2节的实验。因此，确定E值为和ε计算值与和ε实验值的最佳拟合值。

3.结果和讨论

3.1. 细胞株的测量

成骨细胞的变形行为如图5所示。原始细胞直径约为15 pm（图（见第5（a）段）。当通过微注射器泵对隔膜施加压力时，细胞逐渐被压缩并去氧

图 5. 使用细胞压缩微器件的细胞变形的顺序延时图像。由于施加的压力，细胞形状逐渐改变 ，并在压力被移除时恢复到原始形状。

图 6. 应用之间的关系压力和细胞株。 对细胞施加gt;2.0 kPa的压力

图 7. 平均细胞株的变化。误差线表示标准偏差。电池形状表现出迟滞 ，以响应施加压力的增加和减少。

图 8.计算成骨细胞的杨氏模量。数据点表示实验值，红线表示最小二乘法拟合的理论值。这些细胞在相同的实验条件下经隔膜压缩。

由隔膜形成，其同时增加了细胞直径（图。（见第5（a，b）段）。在2.0 kPa的压力下，电池直径约为20 pm，是原始值的1.3倍（图。第5（c）段）。当压力被移除时，隔膜返回到原来的位置，细胞恢复其原始形状（图。5（d-f））。在其他细胞中观察到相同的行为;当施加3.0 kPa的压力时，电池直径从13克变为19克，增加了1.5倍。

施加的压力与细胞应变之间的关系如图6所示。应变随压力的函数而增加;当施加2.0 kPa的压力时，该值为0.3（平均值：0.2;范围：0.2-0.3）（图。这些结果表明，细胞在约30%应变时具有弹性变形区域。

3.2. 杨氏细胞模量的估计

图8显示了P和黑点之间关系的结果，黑点是实验值。使用方程在方程（7）的基础上评估实线。（1） 和 （8）。杨氏模量范围从3.8到4.2 kPa，这是根据他计算的'εd'和'P'的最佳拟合值到εd和P的实验值确定的。例如，一项研究确定，附着在细胞外基质蛋白，无rmal玻璃板和聚-1-赖氨酸上的成骨细胞的杨氏模量约为1.0-2.0 kPa（Takai等人，2005）。在塑料组织培养骨髓基质细胞或3-氨基丙基三乙氧基硅烷接枝的二氧化硅，值为0.3-30 kPa和4-200 kPa，并且对于在钴铬，钛和钛钒等植入材料上培养的Saos-2成骨细胞中，值为2.2-8.8 kPa（Domke等人，2000）。因此，使用我们的设备测量的成骨细胞的Ybung模量与先前公布的值相当（Domke等人，2000;高井等人 2005年）。然而，由于细胞的球形，细胞中的应力应变关系并不均匀。因此，通过使用方程的一维关系（6）对应力-应变关系进行建模，很难实现杨氏模量的估计。考虑到这一点，在本研究中，明显的杨氏模量可能比杨氏模量更合适。未来的研究应采用数值模拟等综合方法来更精确地计算杨氏模量

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