关于工程大肠杆菌过量产生芳香族氨基酸和衍生化合物的研究外文翻译资料

关于工程大肠杆菌过量产生芳香族氨基酸和衍生化合物的研究

作者：Alberto Rodriguez, Juan A Martiacute;nez, Noemiacute; Flores, Adelfo Escalante, Guillermo Gosset and Francisco Bolivar *

摘 要

用重组微生物发酵过程生产芳香族氨基酸来满足全球需求是一种有效的方法。此外，还有大量化合物与消化药物有可能从该代谢途径的中间体中合成得到。然而，与其他氨基酸和初级代谢物相反，芳香族氨基酸构建块的人造渠道是以复杂的方式实现对其途径的中枢代谢的。因为该路径的长度以及复杂的调节逐渐需求更多的整体就业方法，所以只有促进补充工具和技术的合并，才能超越代谢和监管瓶颈。在过去几年中，关于这个问题，已经获得了的相关看法，尤其是在关于转基因大肠杆菌菌株的研究中的看法。在运用组合代谢工程策略的条件下，大肠杆菌菌株的生成，表征和优化，使合成生物学，系统生物学和生物过程工程的发展取得了显著的进步，因此能将其用于过度生产芳香族氨基酸以及其中一些前体和相关化合物。在本文中，我们回顾和比较了近期关于修改芳香族氨基酸代谢性状以达到这些目标成功的报告。

关键词：芳香族化合物，大肠杆菌，代谢工程，系统生物技术，合成生物学，莽草酸通路，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸

1. 介 绍

芳香族氨基酸（AAA），L-色氨酸（L-TRP），L-苯丙氨酸（L-PHE）和L-酪氨酸（L-TYR）是芳香族生物合成途径的最终产物（SHK），SHK连接中心碳代谢（CCM）与氯霉素（CHA）的生物合成，是AAA生物合成终末分支中最后的共同前体（图1）^[1,2]。这些途径存在于细菌和几种真核生物体中，如子囊菌纲，复合物和植物^[3,4]。AAA是高等动物和人类饮食中的主要成分，因此它们用作膳食补充剂（例如，由被谷物和大豆饲养的猪和家禽制作而成的膳食中L-TRP的含量很低）和制药工业的关键前体化合物（例如L-PHE是合成人造甜味剂阿斯巴甜的关键成分，而L-TYR是苯丙酮尿症患者的基本膳食组分，是作为L-DOPA或黑色素生成的起始物质）^[5]。年度全球氨基酸产量估计高于450万吨/年，大多数氨基酸市场增长约10％以上^[6,7]。在芳香族氨基酸中，L-TRP的市场规模超过14000吨/年^[8]，L-PHE的生产量超过3万吨/年^[9]。

通过重组微生物的设计、修改和培养，高价值商品的生产成本可以有效地得到确定。特别是，从AAA生物合成途径开发的化合物积累的有效微生物过程的开发对于代谢和生物工程技术人员来说并不是一件容易的事情。二十多年来，技术人员相当大的努力一直是针对着病人的特征，即超越了该途径的天然紧密代谢调节。这些持续的努力依赖于由B.D.组的芳烃化合物的生物合成的先驱作品获得的知识。Davis，F.Gibson，C.Yanofsky，A.J.Pittard，K.M.赫尔曼和J.W.弗罗斯特等人的贡献在过去得到了全面审查^[2,10-12]。

最近，omics规模数据的可用性已经在代谢重建和模型方面取得了重大进展，从而产生了更好的应变发展^[13]。同样，通过合成分子工具的快速扩张推动的组合和进化方法的更多使用，开启了测试基因表达系统和遗传背景的新型和大型组合的可能性^[14,15]。此外，关于优化发酵条件的努力成功地扩大了许多AAA生产过程，同时提供了对工程菌株的生理学行为的重要反馈^[16,17]。然而，操作工具和技术的可用性以及生理和分子信息的数量在目前用于生产AAA的微生物中不均匀分布着。这些病例有助于将大肠杆菌定位为是具有大多数报道的成功病例的生物体，还是产生广泛的良好表征的生产菌株^[18,19]。

在本文中，我们回顾了大肠杆菌菌株生产，表征和优化方面的一些显着进展，用于过量生产AAA，其中还包括一些重要的前体和相关化合物。 虽然这些研究根据每种情况的不同，对采用的主要方案进行了分类，但这种方法的不断扩大和互补性已经鼓励科学家应用基于系统的观点^[20,21]。因此，本文选择和讨论了使用不同策略的近期作品和有关该主题的代表性作品。

图1 AAA路径在大肠杆菌中的示意图，包括其转录和变构调节控制电路。中心碳代谢中间体和基因显示：PPP（戊糖磷酸途径）; TCA（三羧酸循环）; E4P（赤藓糖-4- P）; PGNL（6-磷酸D-葡萄糖酸-1,5-内酯）; PEP（磷酸烯醇丙酮酸）; PYR（丙酮酸）; ACoA（乙酰辅酶A）; CIT（柠檬酸盐）; OAA（草酰乙酸）; zwf（葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶）; tktA（转酮醇酶I）; pykA，pykF（丙酮酸激酶II和丙酮酸激酶I）;lpdA，aceE和aceF（编码PYR脱氢酶亚基）; gltA（柠檬酸合酶）; pckA（PEP羧激酶）; ppc（PEP羧化酶）; PPSA（PEP合成酶）。莽草酸通路中间体和基因显示：DAHP（3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮酸-7-磷酸）; DHQ（3-脱氢）; DHS（3-脱水喔imate）; SHK（shikimate）; S3P（SHK-3-磷酸）; EPSP（5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸酯）; CHA（chorismate）;aroF，aroG，aroH（DAHP合酶AroF，AroG和AroH）; aroB（DHQ合酶）; aroD（DHQ脱水酶）; aroE，ydiB（SHK脱氢酶和SHK脱氢酶/喹啉脱氢酶）; aroA（3-磷酸莽草酸-1-羧基乙烯基转移酶）; aroC（CHA合酶）。终端AAA生物合成途径中间体和基因显示：ANT（邻氨基苯甲酸酯）; PRANT（N-（5-磷酸核糖基）-邻氨基苯甲酸酯）; CDP（1-（邻羧基苯基氨基）-1-脱氧核糖核酸-5-磷酸酯）; IGP（（1S，2R）-1-C-（吲哚-3-基）甘油3-磷酸酯）; trpE，trpD（ANT合酶组分I和II）; trpC（吲哚-3-甘油磷酸合成酶/磷酸核糖基邻氨基苯甲酸异构酶）; trpA（吲哚甘油磷酸醛缩酶）; trpB基因（色氨酸合酶）; PRE（prephenate）; PPN（苯丙酮酸）; HPP（4-羟基苯基丙酮酸）; tyrA，pheA（CHA的TyrA和PheA亚基变种酶）; ilvE（支链氨基酸氨基转移酶的亚基）; aspC（天冬氨酸氨基转移酶的亚基）; tyrB（酪氨酸氨基转移酶）。连续的箭头显示单个酶反应，黑色虚线箭头显示数个酶反应，长时间闪烁蓝色箭头表示变构调节，蓝色虚线箭头表示转录抑制。改编自EcoCyc数据库^[1]。

2. CCM工程：葡萄糖转运，糖酵解，糖异生和戊糖磷酸途径

用于生产可能成功地过量产生AAA的大肠杆菌菌株的代谢工程努力包括：（I）增加直接前体磷酸烯醇丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E4P）的可利用性;（II）增强SHK途径中的第一酶促反应以产生3-脱氧-D-阿拉伯糖基-庚酮酸-7-磷酸（DAHP）;（III）通过去除转录和变构调节来改善通过生物合成途径的活性的碳流;（IV）鉴定和缓解限速酶反应;（V）防止碳流流失于竞争途径中;（VI）加强产品出口;（VII）防止产品退化或再内化。

关于PEP代谢，大肠杆菌使用磷酸转移酶系统（PTS）作为葡萄糖从周质空间转移到细胞质环境的转运和磷酸化的主要系统，消耗一个PEP分子转化为丙酮酸（PYR）^[22,23]。该反应产生一分子的葡萄糖-6-磷酸，其被糖酵解途径分解代谢，产生两个PEP分子（图1）。PEP是一种前体，其进食几种生物合成途径，并且通过底物级磷酸化参与ATP生成ADP过程或间接作为乙酰辅酶A（ACoA）前体。当大肠杆菌在含有葡萄糖的矿物肉汤中作为唯一的碳源生长时，PTS消耗可利用的PEP的50％，而其他酶如PEP羧化酶，PYR激酶，UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮酸转移酶和DAHP催化的反应合成酶（DAHPS）分别消耗约16％，15％，16％和3％的剩余PEP ^[23,24]。因此，PEP可以通过PTS和PYR激酶I和II（分别由pykF和pykA编码）转化为PYR，并且PYR由PYR脱氢酶多酶复合物（由aceE，aceF和lpd编码）转化为ACoA，反应连接具有三羧酸循环（TCA）的糖酵解途径^[1]。此外，PEP和PYR是CCM的关键中间体，因为它们是决定这些中间体代谢命运（生物合成/分解代谢途径和细胞的糖酵解/糖异生能力）的至少六种酶的底物：DAHPS同工酶（AroF，AroG，和AroH分别由aroF，aroG和aroH编码）^[3,11]; PYR激酶I和II; PEP合成酶（PpsA编码）和PEP羧化酶（Ppc，由ppc编码）;和PEP羧激酶（由pckA编码的PckA）^[25]（图1）。

这些节点的详细知识允许制定策略，使得更高的PEP可用性用于芳香化合物的生物合成，包括通过替代酶（例如来自发酵单胞菌的葡萄糖促进剂和葡萄糖激酶）来替代PTS的葡萄糖转运和有磷酸化能力的运动发酵单胞菌（分别由glf和glk编码）^[26-28]，来自大肠杆菌的半乳糖通透酶和葡萄糖激酶（分别由galP和glk编码）^[29,30]，或选择使用生长速率（mu;）比葡萄糖高的PTS衍生物进行适应性进化过程^[31,32]。此外，高PEP的可用性一直是通过调节由一种或两种PYR激酶^[33,34]的失活引起的从PEP到TCA的碳通量的调节，以及通过PEP合成酶的质粒编码拷贝改进PYR向PEP的再循环来进行测试的^{[ 35-37]}。还有人提出了pckA的过表达与通过乙醛酸分流的增强的碳流动相结合，能作为增加芳族化合物产率的策略^[38,39]。增加PEP的另一种方法是，通过直接基因敲除或增加由csrB编码的负调节RNA的表达，来减少碳水化合物代谢的调节蛋白质CsrA ^[40,41]。

另一方面，E4P是参与戊糖磷酸途径（PPP）的非氧化分支中存在的可逆反应的代谢物，以及导致产生芳香族氨基酸或维生素B₆的不可逆反应的底物^[42]。E4P也可以直接由沉默海洛因酮-1,7-二磷酸盐产生，当胞内水平的神经霉糖-7-磷酸盐较高时，反应可能是有利的^[43]。代谢工程报告显示，通过编码转酮酶（tktA）的基因过表达可以实现E4P的可用性显着增加（由芳香族化合物和途径中间体（例如DAHP）的增加产生推断）^{[35,44-46 ]}或转醛醇酶（talB）^[26,47]。另外尝试增加朝向PPP的碳流量以增强芳香族化合物的生产，包括使用缺乏酶磷酸葡萄糖异构酶的突变体^[48,49]，如酶葡萄糖的过表达6-磷酸脱氢酶^[41,50]，或使用多种碳源，主要是己糖，戊糖和甘油^[51-54]。在已经建立足够的前体供应之后，必须将这种碳转化为SHK途径，并去除控制点和限制步骤以增加目标化合物的产生。

3. 解除AAA路径的管理：识别和减轻限速步骤

在大肠杆菌中，DAHPS同工酶AroG，AroF和AroH有助于增加总体DAHPS活性，并分别通过L-PHE，L-TYR和L-TRP进行变构控制（图1）。AroG贡献约80％的总体DAHPS活动，AroF约15％，其余活动归AroH DAHPS^[3,11]。AroG和AroF同工酶都被约0.1mM的相应氨基酸完全抑制，但AroH仅被L-TRP部分抑制。提示L-TRP完全抑制该同工酶的表观无能力是确保当AAA在生长培养基中过量存在时其他芳香化合物的生物合成的足够供应CHA的机制^[3]。已经通过对反馈敏感突变酶的结构分析来鉴定参与变构位点的特定氨基酸残基，导致反馈抗性（fbr）变体AroG fbr和AroF fbr ^[28,31,55]的靶向产生。另外，对变构控制的DAHPS同工酶，它们的转录表达可以通过与AAA复合的tyr-和trp-阻遏物来控制^[3,11]。

因此，DAHPS活性的扩增和失调是过量产生芳香族化合物及其前体SHK的重要策略。引入aroF fbr和aroG fbr的质粒编码的拷贝结合额外的质粒克隆基因tktA或其在基因簇中的染色体整合已经使从CCM向用于生产L-PHE^[11,55,56]、L-TYR ^[5,57,58]和L-TRP ^[59-61]的SHK途径的碳流量增加。由晚期培养阶段中有活性的启动子控制着将aroG fbr基因插入L-PHE产生菌株的染色体中，以抵消在稳定期的DAHPS活性下降，也获得了阳性结果^[62]。

通过去除转录和变构控制点并减轻限制酶反应来实现SHK途径碳通量的进一步增加^[2,11,19,23]。由DHQ合酶（由aroB编码）和SHK激酶同工酶I和II（分别由aroK和aroL编码）催化的反应被认为是限速^[63-65]。此外，还报道了酶quinate /莽草酸脱氢酶（由ydiB编码）催化的反应在L-TYR生产菌株的开发中是有限制的^[58]。通过质粒克隆的拷贝

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