蛋白化学中有机肟化偶合反应研究：包括羰基基团和亲核催化剂外文翻译资料

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蛋白化学中有机肟化偶合反应研究：包括羰基基团和亲核催化剂

Stijn M.Agten, ^a* Philip E. Dawson^b and Tilman M.Hackeng^a

摘要：在肽和蛋白的生物合成中，肟化反应被广泛采用。因反应效率高和肟化产物十分稳定，向蛋白特殊基团位点引入羰基或醛基的方法不断地增加。早期的方法专注于丝氨酸或苏氨酸氨基末端的特定位点的氧化。近期，更注重转氨方法的发展，把酮或醛移入氨基位点丰富的氨基酸。最近，通过转译后修正的工程酶，已可完成蛋白中特定位点的修正，以便容纳含有氨基的基体。类似的，通过具有选择性的酰基氨tRNA或tRNA对与再赋值密码子结合，越来越多的非自然的氨基酸被引入。对于糖蛋白，多糖可用化学方法或生物酶有选择性的修正，以便引入醛基官能团。最后，蛋白的化学全合成是对生物和化学酶法的补充。若（羰基）被引入，肟连接反应中醛基和酮基可被苯胺或一系列苯胺衍生物催化，以调整催化剂的活性、pH值、稳定性和溶解度。版权属于2016欧洲肽科学和John Wileyamp;Sons, Ltd。

关键词：肟；酮；乙醛；苯胺；亲核催化剂；羰基

简介：在过去的十年，肟连接反应引起人们极大的关注，主要在生物偶合反应中，正被广泛采用，如：蛋白合成^【1-6】、生物偶合反应^【7-11】和多价原子的结构^{【3,12-14】}。胺氧基基团和酮基或醛基缩合生成肟基团，对应的产物称为酮肟或醛肟（步骤一）。肟是通式为R¹R²C=NR³的亚胺大家庭中的一员，并且当所有R基团为烷基或芳香基团时，是众所周知的Schiff碱^{【15，16】}。一般，亚胺键不稳定，但氨氧基团中与亚胺键邻近的杂原子（氧在R³上）引起的alpha;效应可确保肟键水解稳定性和偶合的适宜性^【17,18】。酮或醛与联氨可发生类似反应（N在R³），产生腙。该反应虽更不稳定，但对在试管发生的快偶合反应很有用，文献证明同样对可逆蛋白偶合反应有用^【19-22】。

因天然蛋白中不含羰基官能团，则需通过合适的方法引入。 在这篇评论中，我们着重介绍几种已用于蛋白特殊位点肟化的方法。此外，在反应机理清楚的羰基引入反应中，苯胺作为肟化偶合的催化剂，引出一些芳香胺类的催化剂。这些催化剂的发展进程和活性将会再讨论，以便读者形成更完整思路，可在蛋白化学中把肟化作为一种方法。

羰基基团

向肽蛋白中引入羰基涉及肟化偶合反应中的关键步骤。在最近的十年，一些新技术已经涌现，包括全化学合成法从所需酮或醛出发的遗传算法。引入羰基基团的方法在不断更新，如：化学处理、酶修饰法、遗传算法、糖修饰法和化学合成法。

羰基基团一个最大的优点是它不存在于天然蛋白中，不能发生副反应和无需保护基团就可进行特殊位点的修饰。但同时也注定了它不能作为起始修饰位点。

化学处理

在向蛋白中引入羰基的早期方法中，是对所需分子的特殊位点残余基团进行或多或少的修饰。为人们最熟知也是最常使用的是用高碘酸钠来进行氧化。

*注：Stijn M. Agten, Department of Biochemistry, Maastricht University, Maastricht, Netherlands.E-mail:s.agten@maastrichtuniversity.nl

a注：Department of Biochemistry, Maastricht University, Maastricht, Netherlands

b注：Department of chemistry, The Scripps Research Institute, la Jolla,CA,USA

更具体地说，该反应利用1-氨基-2-羟基化合物对高价碘离子如偏高碘酸根离子有较好的选择性（步骤2）^【24】。只在丝氨酸或苏氨酸的氨基末端位点存在该官能基团^【25-27】。反应试剂的选择性，在保持易氧化氨基酸稳定性的条件下，确保反应的专一性。氧化分裂反应生成乙醛酰产物，可用于与胺氧基反应^{【3,28-30】}。该方法的缺点是丝氨酸或苏氨酸必须存在末端氨基，当天然蛋白中不存在时，需通过突变引入。转氨作用被发现及完善,以为了可向更广范围的天然蛋白中引入羰基。在早期工作中，Dixon发现经乙醛酸盐和二价金属离子如处于pH5—7的Cu(Ⅱ)可被转氨为所需的羰基化合物^【27】。在转氨作用中频繁涉及生物辅助因子，发现5rsquo;—磷酸盐-吡哆醛（PLP）在于Cu(Ⅱ)的偶合反应中次于乙醛酸盐。最近，在试剂PLP下的无金属离子转氨对完整蛋白的温和氨基末端转氨已取得成效。Francis发现该反应其实无需金属离子参与，且在中性pH和37℃下有较好的产量。该反应不同于Pro的，可适用于任何氨基末端氨基酸，生成相应的乙醛酰（Gly）和酮肟。反应产量取决于末端氨基酸。因为PLP本身的加合物，同时Francis和Trp采用Pictet-Spengler机理进行反应，Francis、Trp、Pro和Lys进行的反应产量都较低。此外，因为该反应产量由所用的氨基酸决定，则当进行肟化反应时，需采取必要的措施。当原料为谷氨酸盐时，转氨产物的产量较高，但该产物不能进行肟化反应，可能因为酮和谷氨酸侧链反应生成的中间产物太稳定^【32】。通过修改氨基酸的2号和3号位置，可实现最优化的转氨反应和随后的肟化偶合反应。在赖氨酸的3号位反应可得到较高的反应产量，但在苯基丙氨酸或组氨酸上反应时，并未有较高产量。笔者归纳发现，反应的内部顺序的协同作用是反应产量不同的本质^【32】。

酶修饰

为了把羰基引入蛋白内部，研究者利用转译后修饰的天然酶的高度专一性。一种最直接的方法是向专一酶的基质中引入羰基官能团，如法尼基转移酶（PFTase）就可这样使用的^【33】。实际上，该酶可催化类异戊二烯基团与二磷酸和半胱氨酸中硫原子的反应。只有当半胱氨酸出现在一个碳末端存在可识别位点的蛋白中才可被修饰。在Caax盒子中，那个可识别位点应包含四个氨基酸，其中C代表异戊烯基化的半胱氨酸，a为脂肪族的氨基酸，X则为法尼基转移酶中的M、S、Q、A或C。可修饰法尼基二磷酸基质，使之含有仍可被法尼基转移酶识别的简单醛基或芳香醛基^【34】，如大肠杆菌中的硫辛酸连接酶（LpIA）就可这样使用。该酶可催化硫辛酸与具有13号氨基酸识别位点的LpIA受体蛋白质的反应。可通过包裹着酶的基质突变，以便突变基质可与合成的羰基基团相适应^【35-37】。可通过LpIA的Trp37突变，实现芳香醛与硫辛酸机制的偶合。肼探针可用于所需蛋白的专一定位^【38】。作为可实现反应催化的微管蛋白酪氨酸连接酶，一般会使alpha;微管蛋白中羰基基团末端存在酪氨酸残余物。微管蛋白酪氨酸连接酶可识别酪氨酸基质中十分微小的改变，如3-甲酰酪氨酸。该酶可通过肼标签对活细胞中的alpha;微管蛋白进行标记^【39】。随后，发现该酶可用于向任何出现可识别位点的蛋白中引入3-甲酰酪氨酸。识别序列（微管蛋白标签）包含14个氨基酸，且需被连接在需所研究蛋白的碳末端^【40】。通过辅助因子蛋白引入羰基官能团唯一的限制是受体位置。

通过酶引入活性羰基官能团的可行方法是采用酶，修饰天然氨基酸侧链使之成为活性基团,例如：把半胱氨酸中特定位点修正为甲酰甘氨酸的。通过甲酰甘氨酸合成酶（FGE）作用，进行修饰^【41,42】。发现所需的共有序列是LCXPXR，其中X为任意氨基酸。FGE将半胱氨酸残余物转换成甲酰甘氨酸，用于随后的肟化偶合反应。例如，LCXXR基序被连接在不同蛋白的N和C末端，半胱氨酸可被转变为甲酰甘氨酸。PGE在大肠杆菌中为天然蛋白，当与原核的FGE共同使用时，反应产量最大^【42】。

遗传算法

酶修饰法需在修饰位点附近引入特定的肽序列。为了限制修饰在单个氨基酸残余物，将密码子重赋值以便识别负载非天然氨基酸的tRNA。利用氨酰基tRNA合成酶/tRNA对的选择性，可在细胞中使用此法^【43】。通过此法，含羰基基团的氨基酸可被引入蛋白中的特定位点。非天然氨基酸的普遍使用法是通过p-乙酰基-L苯基氨基酸进行肟化偶合反反应，以在蛋白中琥珀抑制无义密码子位点引入芳香羰基官能团^【44】。随后，在试管中和活的有机体内，酮类的基团可用于在特定位点用荧光团或维生素H标记蛋白。后来发现，p-乙酰基-L-苯基氨基酸的类似物m-乙酰基-L-苯基氨基酸同样可实现^【45】。这些酮类的氨基酸曾被用于PGE的自旋标记和抗原结合片段的修饰^【46-48】。酮试剂是化学惰性的，对该反应存在限制，但对有利于细胞内反应稳定性，且肟化偶合反应典型反应条件是在低pH、高浓度下长时间反应。其他含有羰基的氨基酸进行了类似实验，如含双酮基氨基酸被合成，同时以类似p-甲酰基-L-苯基氨基酸的方式被使用^【49】。

在羊毛硫肽大家庭中发现通过遗传修饰以引入羰基基团的途径。这些小蛋白被核糖体合成，然后翻译后修饰以加入硫醚桥。为了实现这个目的，将丝氨酸和苏氨酸残余物脱水为相应的Dha和Dhb。随后，序列中的半胱氨酸的反应将形成硫醚桥。在最终序列1号位置不能形成硫醚桥脱水的丝氨酸或苏氨酸中羰基基团可被用于一些羊毛硫肽化合物的N末端修饰。在苏氨酸脱水和前导肽移动的情况下，N末端的烯胺会自发水解为alpha;酮酰胺。研究发现，遗传算法可用于许多羊毛硫肽化合物，以引入可用胺氧基修饰的N末端羰基^【50】。

化学合成

核糖体合成对大分子蛋白有明显优势，但化学合成和半合成可对与生物组装机器相兼容的蛋白进行修饰。固定相肽合成和化学耦合多可用于蛋白全合成，其中羰基可被插入任何所需位点，可通过含羰基的氨基酸构建块实现。前面在遗传算法中提到的p-甲酰基-L-苯基氨基酸同样可用于肽合成。另外，可通过丝氨酸或苏氨酸与正交保护的赖氨酸耦合，实现在特定位点引入醛基。通过琼斯氧化商品羟基脯氨酸，得到的酮脯氨酸亦可使用^【51】。在一项研究中，酮脯氨酸是脯氨酸4-水解酶的中间产物，最近研究发现，可被三螺旋胶原蛋白所容纳。可通过肟化偶合反应，将胶原蛋白序列中酮脯氨酸基团引入生物素标记^【52】。此外，可通过乙醛酰基团，将醛基引入肽中。引入功能基团方法是在C末端用特殊肽基树脂和在N末端用新设计的氨基酸构建块^【53,54】。酮酸可用于更专一位点的修饰。蛋白或被赖氨酸正交保护的蛋白的N末端可用于引入特定位点的羰基，可通过丙酮酸和乙酰丙酸来实现^{【1,2,11,14,55】}。但不是任意的酮都可以，我们发现乙酰丙酸更易于进行肌肉内的环化反应^【56】。反应生成环，不能与胺氧基进行肟化反应。在同样研究中，正寻找乙酰丙酸的替代品。发现将碳链延长一个碳原子即可避免成环反应。此外，发现芳香酮比烷基酮的反应性更弱^【56】。

除了使用含羰基基团的氨基酸，可通过特定侧链上的反应向化学合成的或核糖体表达的蛋白引入羰基基团。为克服短的肽片段无序本质，需加入一些稳定元素，这些元素大部分是惰性元素。但最近发现可通过二氯丙酮大环化，引入羰基基团^【57】。二氯丙酮可与肽序列中的亲核基团反应，如半胱氨酸。可通过交联反应，用含胺氧基的化合物修饰产物^【57】。

糖修饰法

前面提到，因20中天然氨基酸中都不含羰基，所以天然蛋白中不存在羰基基团。可是，糖基化蛋白中含有的糖组分可作为羰基引入的起始位点。在合成法中，可通过经GalNac修饰的Ser/Thr构建块合成邻位糖蛋白。在乳蛋白酶催化下，半乳糖衍生物可被转化为6个碳的醛，随后可通过肟化偶合反应，与寡糖结合^【58】。此外，可利用糖的自然开环优势，生成的醛以与封闭的班缩醛截然相反的形式存在。可通过肟化偶合反应对自由的醛基进行修饰^【59,60】。有趣的是，经肟化偶合反应后，糖的环结构可被保留^【60,61】。另外，唾液酸也可用于向糖结构中引入羰基基团。可用高碘酸钠对唾液酸中的二醇进行氧化（步骤三）^【62】。起初，唾液酸的氧化反应用来测定生物混合物中唾液酸的量。产物醛与间苯二酚进行缩合反应，以合成稳定的可用于定量唾液酸的色原^【63】。后来，可通过糖的特定位点修饰，向糖结合物中引入放射性标记^【64,65】。最近，唾液酸的氧化与肟化偶合反应结合以向蛋白中引入新的官能团^【66】。这个方法可用来对细胞表面存在含唾液酸的糖的活细胞进行标记^【67】。最后，可通过向细胞加入N-乙酰基甘露糖胺（ManLev）非天然衍生物，对细胞表面的糖进行修饰。该糖含有羰基基团，可被转化为非天然的唾液酸，且可与细胞表面的糖结合。随后，细胞表面的羰基基团可和肼反应用来标记细胞（表一）^【68】。

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