反相色谱-电感耦合等离子体与质谱联用法分析大米中的铅形态

作者：Ji Xia, Yong Fang, Yue Chen, Yushi Pan, Peng Li, Mei Xue, Qiuhui Hua,

单位：南京财经大学食品科学与工程学院

摘要：在这项研究中，开发了一种使用反相色谱-电感耦合等离子体质谱法（RP-HPLC-ICP-MS）分析大米样品中铅（Pb）形态的方法。尤其是通过色谱条件的优化来分离四种Pb物质，即Pb^II，三甲基氯化铅（TML），三乙基氯化铅（TEL）和四乙基铅（TTEL）。该方法在C₁₈色谱柱上使用甲醇和乙酸/乙酸铵进行梯度洗脱。此外，在超声波的辅助下，选择了1％EDTA与2％甲醇的混合物作为大米样品提取液。结果表明，采用最佳方法可以在25min内分离出4种Pb，其中检出限为为0.032-0.631micro;g L^-1，相关系数（R²）为0.998-0.999。这种方法成功地用于研究水稻中的Pb种类，并且Pb^II是水稻样品中的主要种类。

关键词：铅形态；大米；反相色谱；HPLC；ICP-MS；食品分析；食品成分

1.简介

铅（Pb）是微量重金属元素之一，可在许多农作物中积累^[1]，并且可能通过食物链进入人体，进而损害免疫、消化系统和其他系统，引起多种健康问题，尤其是在幼儿中^[2]。此外，Pb的毒性主要与神经系统中的神经元细胞损伤，诱导脑细胞凋亡，干扰神经递质的储存和释放以及引起脂质过氧化损伤有关^[3]。水稻是全球一半以上人口最重要的农作物之一，尤其是对于以稻米为主要食品的中国人民而言^[4]。但是，重金属（例如铅，镉等）从环境中进入米粒，已成为影响中国人民健康的关键问题。Fang等(2014)评估了92个来自中国的大米样品，在近5％的样品中，铅的浓度超过0.2mg kg^-1，这是中国大米中允许的最大浓度^[5]。

而且，Norton等(2014)对来自13个国家和6个地区的1578个大米样品中的Pb浓度进行了调查，其中近0.6％的样品超出了中国允许的最大浓度^[6]。

实际上，Pb的毒性不仅与其数量有关，而且还取决于其种类。在环境中发现的Pb的种类主要是无机铅的和有机铅。通常，有机铅比无机铅更具毒性。大量使用的汽油抗爆添加剂和制造行业的废物中的有机铅化合物，特别是四烷基铅化合物及其降解产物，包括三甲基氯化铅（TML），三乙基氯化铅（TEL）和四乙基铅（TTEL），是食品中铅污染主要的来源^[7]。

目前，Pb的形态分析主要取决于气相色谱（GC）或高效液相色谱（HPLC）等分离技术以及检测设备。与GC相比，HPLC在室温下不发生衍生作用的情况下具有更优越的操作性能。近年来，HPLC结合了元素形态分析的技术，例如原子吸收光谱（AAS），原子发射光谱（AES），原子荧光光谱（AFS）和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）被广泛应用^[8]。

ICP-MS具有高灵敏度、高精度、动态线性范围宽、多元素分析能力等突出优势，有助于重金属的检测^[9]。因此，HPLC-ICP-MS是铅形态分析的更好选择。目前，许多研究都集中在食品中的砷和汞形态分析上^[10]，但尚未报道大米中铅形态分析。同时，在食品中铅形态检测中存在的问题是精度较低，在复杂食品基质中的应用很少以及提取效率较低等问题。Al-Rashdan等(1992)开发了一种使用反相（RP）HPLC-ICP-MS分离四种Pb物质的方法，即Pb^II，TEL，三苯基氯化铅和TTEL^[10]。但是，他们都没有提出将其应用于实际样品中。Ebdon等（1998）通过同位素稀释法结合HPLC-ICP-MS对雨水中的Pb形态进行了研究，不幸的是，在加标实验中未获得良好的精密度^[11]。Pan等（2005年）使用RP-HPLC-MS分离各种铅标准溶液^[12]。但是由于技术设备的限制，它们的方法不适用于TTEL，并且也没有进行实际样品的应用。同时，虽然已经进行了多种食品中重金属的提取方法的研究^[13]，但由于Pb物种的提取效率低，很少有方法适合于形态分析。因此，提出一种基于有效萃取方法和RP-HPLC-ICP-MS进行铅形态分析的分析方法至关重要。

这项工作的目的是：（a）优化色谱法，以分离在环境中通常观察到的四种Pb形态；（b）提出一种对大米样品中Pb物种的有效提取方法；（c）将优化后的色谱方法应用于分析大米提取物中铅的种类，以说明该方法的潜在适用性。

2.实验性

2.1试剂和材料

铅含量相对较高的样品是从我们之前的调查中获得的^[14]，普通大米分别来自南京市和射阳市。另外，GBW 10043米粉是从国家标准物质中心（中国北京）获得的。

氯化铅（PbCl₂），TML，TEL和胃蛋白酶购自Sigma Chemicals（St. Louis, MO, USA）。TTEL由南京环境监测中心捐赠。甲醇（HPLC级）购自Tedia（Fairfield, OH, USA）。硝酸（65％，GR）购自默克公司（德国达姆施塔特）。醋酸（GR），醋酸铵（GR），0.1mol L^-1盐酸（GR）和EDTA（AR）购自阿拉丁化工（中国上海）。

所有其他化学品至少为分析纯，并且无需进一步纯化即可使用。在整个实验过程中，使用从Milli-Q水系统（Millipore, Bedford, MA, USA）获得的双去离子水（DDW）。将所有玻璃器皿在30％硝酸中保存至少48小时，并用DDW洗涤3次。

在甲醇中制备有机铅的储备溶液（20 mg L^-1Pb液）。每天新鲜配制7.5％甲醇于1％硝酸中成工作溶液。将所有玻璃器皿在30％硝酸中保存至少48小时，并用DDW洗涤3次。

2.2仪器仪表

选择美国安捷伦1260高效液相色谱系统配有RP C₁₈ 色谱柱（150mm times; 4.6mm，5micro;m）进行铅形态分析。将该柱冲洗至少一小时以进行适当的调节。色谱柱出口通过特氟龙传输线直接连接到ICP-MS系统的同心雾化器，而无需通过UV检测器。使用7700 x ICP-MS（Agilent Technologies, Palo Alto, USA）设备作为元素检测器。优化信号强度通过使用20micro;g L^-1的Pb^II标准溶液在相应的流动相中准备。由于Pb引起的信号强度既可以记录为数值，也可以由实时峰值表示。仪器的工作条件列于表格1。

表格1 ICP-MS和HPLC的操作条件

2.3总铅的测定

微波消解后，采用ICP-MS测定大米样品中的铅含量。将大约0.3克大米样品和5毫升硝酸添加到消化容器中。放置过夜以进行消解后，将样品通过微波消解系统（CEM, USA）在800W下消解15分钟，然后在1200W下消解25分钟。随后，将消化物冷却至室温，用1％硝酸稀释，并通过ICP-MS分析，所述ICP-MS具有7Li，89Y和205Tl的混合内标。此外，总铅的测定方法已针对GBW 10043米粉进行了验证，该粉已被用作验证的参考材料。平行准备了三个子样品和空白样品进行分析。

2.4铅化合物的提取工艺

所有大米样品都除去了麸皮，并磨成了粉末，通过100目筛。分析之前，将大米样品存储在4℃的冰箱中。根据先前的研究^[15]，用不同的提取溶剂超声辅助提取大米样品，包括盐酸，胃蛋白酶，EDTA/甲醇和乙酸/甲醇。

2.4.1.酸提取

大米样品用0.1 mol L^-1 HCl^[16]提取。将约5.0 mL的0.1 mol L^-1盐酸添加到50 mL锥形瓶中的0.2 g大米样品中。

2.4.2.酶提取

根据先前的研究^[17]，将5.0 mL溶解有0.02 g胃蛋白酶的DDW加入到锥形瓶中0.2 g大米的样品中，并将溶液的pH调节至2.0。

2.4.3.用EDTA/甲醇和乙酸/甲醇萃取

将溶了5.0 mL的10 g L^-1 EDTA的2％（v/v）甲醇溶液、1.0 mL乙酸和4.0 mL甲醇溶液分别添加到0.2 g大米样品中^[18]。

然后将所有溶液在超声浴中处理30分钟。EDTA/甲醇法的超声波浴的温度为65℃，其他三种方法的超声波浴的温度为37℃。另外，在此过程中超声波浴的功率为400W。超声浴后，室温下将溶液在震荡水浴中再摇晃4小时，并在5000 rpm下直接离心10分钟，收集上清液，并通过0.22 mm膜过滤，然后进行分析。

此外，一式三份地分析了子样本和空白样本。通过比较不同水稻样品中铅的含量和总铅的含量来评价不同方法的提取效率。

2.5.分析性能特征

为了使用质谱法确定每种Pb种类，使用相同的设备和流动相对单个标准品进行了重复采样。制备浓度为1 mg L^-1，2 mg L^-1，5 mg L^-1

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