研究文章
使用在分子拥挤条件下制备的印迹微粒对氧氟沙星对映体的CEC分离
摘要：分子拥挤是获得分子印迹聚合物（MIPs）的新概念，具有更大的容量和选择性，这可以改变印迹分子与复合物形成侧方向上的官能单体反应的平衡。在这项工作，首先将分子拥挤剂用于制备MIPs微粒通过沉淀聚合。一个新的分子拥挤系统在聚四氟乙烯和四氢呋喃组成的环境中发展起来的模板（S）-氧氟沙星的存在。部分填充毛细管电色谱（CEC）被用于评估由手性产生的微粒的印迹效应。氧氟沙星的分离。准备中的一些重要参数，即模板单体比率，交联单体和功能单体的影响。研究了MIP微粒的CEC分离上的组成。底线在优化条件下得到了氧氟沙星的分离（Rs =1.53）后期洗脱液（S）-氧氟沙星的最高理论塔板数为5400印迹颗粒的形态学参数，如Brunauer-Emmett-Teller表面积，孔体积和孔径分布也已被确定。与通过常规沉淀聚合制备的MIP微粒相比，在分子拥挤下形成的（S）- 氧氟沙星-印迹颗粒条件，显示较高的选择性（alpha;=1.09）和分离效率（lt;25分钟）CEC模式。
关键词：CEC /挤压剂/微粒/分子印迹聚合物/氧氟沙星
1介绍
分子印迹是一种最先进的技术，通过这种技术可以在模板分子存在下在聚合物基质中构建特异性识别位点[1,2]。后从得到的分子印记聚合物（MIP）中除去模板，留下用于所用模板分子的具有“记忆”的3-D腔。这些优点具有生物聚合物的MIP具有低成本和良好的物理和化学稳定性。由于显着的选择性，MIP已经在酶样催化中找到应用[3]，仿生传感器[4]，抗体模拟[5]，固相萃取[6]，药物输送系统[7]和色谱[8]。
分子印记涉及在印刷分子周围布置可聚合官能单体。这是通过利用非共价键相互作用，如氢键，离子对相互作用等（非共价印记）或印刷分子和功能单体之间的可逆共价相互作用（共价印记）。 尽管与共价方法相关的明确化学计量当然有其优点，但非共价印记和识别多功能技术合成技术的产生在文献中占主导地位，因为它们促进稳定适应和快速合成，与分子识别非常相似天然受体的机制以及文献中报道的大量功能单体文库的可用性。
对于通过非共价印记产生的MIP，可以发生非共价相互作用的单体与模板分子和交联剂一起形成模板和单体的明确的复合物。分子印迹是否成功取决于印迹分子与功能单体之间复合的效率;因此，可以实现产生的MIP的选择性受这些复合物的性质和稳定性支配。然而，由于缺乏在预聚合混合物中获得稳定复合物的通用程序，非共价印记技术仅在有限的情况下仍然有用。因此，已经发现稳定复合物和提高印记效率的努力，包括用计算机辅助合理方法[9]和优化聚合温度[10]以及溶剂稳定复合物[11]来选择合适的功能单体。此外，高压也被作为稳定复合物的手段，并导致更高的特异性[12]。然而，仍然需要一种新的，通用的稳定复合物的方法。
作为生物细胞分子环境的一个重要特征，最近的研究[13-15]显示生物细胞中的分子拥挤影响生物聚合物高阶结构的稳定性，并促进生物分子的结合。在分子印记的情况下，分子拥挤可以使复合物形成侧的印刷分子与官能单体反应的平衡移动。最近，Matsui等人[16]表明模板分子和功能单体之间的分子间相互作用通过分子拥挤来稳定。在基于拥挤的MIP上可以找到比不拥挤的MIP更高的保留和选择性。这表明分子拥挤是产生具有更大容量和选择性的人造受体的有力方法。然而，对于高效液相色谱（HPLC）的手性固定，用分子拥挤法制备的MIP表明柱效低（S.-J.Zhang等，论文提交）[16]，需要做更多的努力。
毛细管电色谱（CEC）是一种混合方法，结合了CE的高分离效率和HPLC提供的各种保留机制和选择性的优点。在CEC中，EOF形成了整个色谱柱并且结果几乎是平的轮廓。因此，基于CEC的MIP分离可以获得更高的色谱柱效率[17-20]。 此外，许多格式的MIP可用于CEC分析，包括整体柱[21-23]，开管式毛细管[24-27]和基于颗粒的技术[28-37]。 例如，使用部分填充技术，MIP微粒可用作背景电解质中的添加剂[31-37]用于CEC，并且已显示其具有更高的对映体分离效率。
目前的工作报道了一种通过沉淀聚合制备MIP微粒的新策略，该策略是在拥挤诱导剂的周围进行的（图1）。沉淀聚合是制备亚微米MIP颗粒的方法[38]。得到的MIP微粒由稀释的单体溶液制备，并且可以通过部分填充技术以CEC模式使用。在CE系统上执行分离所需的少量伪静止阶段使得伪静止阶段的成本不是一个重要问题。此外，MIP的组成和浓度从运行到运行都很容易改变，这有利于快速优化。在本研究中，选择聚苯乙烯（PS）作为拥挤剂并溶于四氢呋喃（THF）（在该实验中用作致孔剂）。氧氟沙星被选为模板，因为氧氟沙星对映体的分离吸引了许多分析科学家的兴趣[39-46]。通过与微粒MIP一起提供的手性分离的能力来评估在这种新聚合体系中的印记效应。重要参数如溶剂和助溶剂的选择，模板与单体的比例，交联类型等，已经研究了单体和功能单体组合物达到合适的尺寸和形态。
2 材料和方法
2.1化学品
S-氧氟沙星和外消旋 - 氧氟沙星从Sigma（St.Louis，MO，USA）获得。 甲基丙烯酸（MAA）来自成都金山化学试剂公司（中国成都）。 甲基丙烯酸丁酯（BMA）和二乙烯基苯（DVB）均购自天津博迪化工（中国天津）。 乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA），三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM），4-乙烯基吡啶（4-VP）和PS购自Aldrich。 甲基丙烯酸3-三甲氧基甲硅烷基丙酯（g-MPS）来自Acros（Geel，Belgium）。 丙烯酰胺（AM）购自北京普博生物技术公司（中国北京）。 2,2-偶氮双（2-异丁腈）（AIBN）由南开大学特殊化学试剂厂提供（中国天津）。 ACN（HPLC级）来自Fisher（New Jersey，USA）。 其他分析试剂来自天津化学试剂公司（中国天津）。 内径100mm，外径375mm的熔融石英毛细管从新诺光纤厂（中国河北）购买。
2.2分子印迹微粒的制备
将模板分子（S）- 氧氟沙星，自由基引发剂（AIBN），功能单体（MAA）和交联单体（EDMA）以比例溶解于圆底烧瓶中的PS-THF（40 mg / mL） 如表1所示。将预聚合混合物超声处理15分钟，然后通过氮气流脱气3分钟。 将烧瓶密封并放入水浴中并在53 ℃下加热。 聚合完成后，从悬浮液中分离MIP微粒部分。 通过连续离心（14,500 rpm，15分钟）洗涤两个级分并在甲醇：乙酸（70:30，v / v）中再悬浮（超声处理15分钟）两次和在ACN一次。最后，将聚合物颗粒干燥并在室温下储存直至使用。
2.3 CEC
由于MIP塞的迁移部分由EOF决定，为了能够使用具有适当长度的MIP塞并且仍然使分析物在MIP之前到达检测窗，使用具有减少的EOF的衍生毛细管。 在这项研究中，一种熔融石英毛细管用g-MPS衍生化。 通过用1mol/L NaOH，水，0.1mol/L HCl和水连续冲洗毛细管2h进行衍生化，然后用氮气流干燥。 然后冲洗毛细管并充满甲苯/ g-MPS（85:15，v/v）溶液。 将该溶液保持在毛细管中过夜，最后用甲苯冲洗毛细管并干燥。
CEC实验在装备有UV检测器的K1050系统（Kaiao，Beijing，China）上进行。使用具有用于CE的CXTH-3000软件的联想个人计算机。电解质由ACN / 10mmol / L，pH 5.0和醋酸 - 醋酸钠缓冲液（90:10，v/v）组成。 MIP微粒悬浮在电解质中到5克/升。用电解质稀释的10mmol / L水溶液制备样品，得到10mmol / L浓度的样品。使用0.2-mm微孔过滤膜过滤水基缓冲液。通过超声处理将所有溶液脱气。一种g-MPS衍生的毛细管（总长47.5厘米;有效长度37.5厘米）用于CEC分离。在每天进行第一次CEC分析之前，将毛细管用水和电解质冲洗15分钟。连续运行之间，毛细管用电解液冲洗5分钟。将MIP微粒悬浮液和样品分别以15mbar流体动力学引入6.0s和4.0s。分离电压为5kV。 UV检测在254nm进行。
在本文中，分离因子使用alpha;进行评估，该计算由[47]
alpha;=t2 /t1
因为一些分析物在EOF之前被洗脱; t1和t2是第一和第二峰的保留时间。
对映异构体分离度由归一化分离指数△tR/tR1表示，其中△tR是对映异构体在峰最大值处的洗脱时间差，tR1是第一洗脱对映异构体的保留时间。
2.4 MIP微粒的表征
扫描电子显微镜（SEM）用来MIP颗粒的表征。 MIP颗粒将样品分散在玻璃载玻片上并胶合铝SEM扫描仪。 获得图像之前，样品被溅射涂覆黄金。 所有获得的SEM图像都是使用Shimadzu SS-550扫描电子显微镜，在15kV和灯丝电流下运行60毫安。所有的颗粒被分散和稀释甲醇，粒径由Zetasizer Nano ZS（Malvern Instrument，英国）。 不同型号的分布和体积加权平均直径分别为如表1所示获得。
2.5气体吸附实验
Brunauer-Emmett-Teller（BET）表面区域和MIP颗粒的孔隙率是在77K下测量的氮吸附 - 解吸等温线，使用Micromeritics ASAP 2020表面积和孔隙度分析仪（Micromeritics Instrument，Norcross，GA，USA）。样品在601℃真空脱气（10 -3乇）4小时吸附实验。 Barret-Joyner-Halenda（BJH）方法用于计算孔径分配。 开尔文方程也用于计算孔隙率和孔径分布。 BET区域的值（SBET），t图的外表面积（St），累积体积直径在1.70和50.00 nm之间的孔（Vp）和孔径平均值（Dmean）显示在表1中。
- 结果与讨论
3.1（S） - 氧氟沙星 - 印迹颗粒
3.1.1孔隙原的选择
PS已被证明[16]作为拥挤代理有效增强本体聚合中MIP吸附剂的保留，其中采用氯仿作为溶剂。 然而，氯仿-PS未能通过沉淀制备微粒聚合。 因此，适用于新的致孔剂系统。需要开发拥挤代理来准备MIP微粒。 在我们的研究中，它确立了THF是一种好的选择。 将PS加入THF，MIP颗粒后在短时间内合成（1.5-2小时）。 有趣的是，MIP在没有加入PS的情况下24小时内不产生颗粒，即使延长了反应时间。
通过SEM研究MIP颗粒的形态。 如图2所示，在PS-THF中制备的所得颗粒表示较宽的尺寸分布。 相反，在ACN中制备的粒子显示出窄的分散球体。 两种微粒的差异可能促成两种孔隙原中颗粒形成和生长的不同机理。
所有在PS-THF中制备的颗粒显示低孔隙度（表1）。为了比较，将MIP微粒制备成沉淀聚合中的常规致孔剂ACN。有趣的是，用纯ACN形成的MIP G显示出明显的孔隙度和总表面积106.9平方米/克。相比之下，用纯氯仿制备的MIP H仅表明总表面积为12.3m 2 /g。MIP具有与以氯仿作为致孔剂的先前制备的印迹材料的N 2吸附分析相似的物理特性[48]。
从图2中显示了从N 2吸附（图3A）和解吸（图3B）获得的孔径分布曲线在图2中。从N 2吸附获得的实验分布没有显示最大值，表明非常宽的分布在PS-THF中制备的MIP的孔径。在吸附过程中，聚合物表明在微孔边界附近的切向行为（lt;5nm），高表面积材料在这个地区具有更陡峭的形状。此外，精细结构的出现，结果表明有些孔径大小优于其他。例如，MIP D的吸附几乎完成10nm的范围内，而MIP A的吸附过程，MIP B和MIP E几乎集中在该地区,小于5纳米。相比之下，实验分布从解吸数据获得的曲线对于MIP比NIP A更宽（A，B和C），但对于MIP A，曲线显示肩。对于非印迹聚合物，已经测量了具有从最低介孔极限到约80-100nm的不均匀孔径的材料。腔尺寸的宽非均匀分布，由基于吸附的曲线显示，可以通过在模板分子和功能单体之间形成不同组成和构象的预聚合复合物来解释。考虑到未聚合的MAA单体的剩余部分，可以解释在MIP A的情况下仅肩部的外观与在模板提取过程中从聚合物中洗出的不同组成的模板形成复合物强烈地相互作用。
3.1.2模板浓度对聚合物形态的影响
预聚合络合物的形成影响聚合的进展，从而导致表面形态的差异[49]。 调整添加到另外恒定的预聚合混合物中的模板量改变了MAA与印迹分子的摩尔比。不同量的模板导致不同大小的MIP颗粒（表1）。 例如，MIP A的
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