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调整肽pi;电子水凝胶力学性能的交联方法

化学系，克里格艺术与科学学院，纳米生物技术研究所，sect;材料系约翰斯·霍普金斯大学Whiting工程学院科学与工程学院，北查尔斯街3400号，马里兰州，巴尔的摩21218，美国

翻译组织工程中心，约翰霍普金斯医学院，400 North Broadway，Baltimore，Maryland 21287，美国

支持信息：

摘要：

自组装肽作为生物活性材料被广泛地用作再生医学和药物递送的应用，尽管它们相对较弱的非共价相互作用经常使它们易于机械破坏和溶剂侵蚀。在这里，我们描述共价交联如何增强自组装pi;共轭肽水凝胶的机械稳定性。我们设计出显示不同反应性官能团的短肽 - 发色团 - 肽序列，其可以与适当改性的双官能聚乙二醇（PEG）的小客体分子形成交联。这些肽响应于水性环境中的pH而自组装成一维纤维网络。促进交联反应以通过物理交联（预组装的）pi;-缀合的肽链中的共价键来产生锁定到位的二级网络。使用流变学测量来评估网络的机械性能，并通过红外光谱进一步证实了交联伴随的化学变化。此外，我们通过引入细胞外基质（ECM）衍生的Ile-Lys-Val-Ala-Val（IKVAV）和Arg-Gly-Asp（RGD）生物活性表位来修饰这些可交联的pi;-缀合物，以支持人神经干细胞和祖细胞 细胞（hNSCs）分化。hNSCs分化为IKVAV衍生的pi;-缀合物的神经元，而含RGD的肽不能支持细胞附着。这些发现提供了对pi;-缀合的肽水凝胶剂的生物化学和电子性质的深入了解，用于创建人造ECM以实现先进的组织工程应用。

■介绍

衍生自pi;-共轭短肽的自组装水凝胶已被开发用于光电子学以及从生物传感器到组织工程的生物医学应用的有希望的材料的开发。^1-5这些肽功能化的pi;-共轭物的出现的生物化学和电子性质通常依赖于在组件内对pi;电子部分施加的分子间相互作用的程度和局部几何形状。^6-10肽pi;共轭物经历自发自组装成主要依赖于包括库仑，氢键和范德华相互作用的弱非共价力的淀粉状原纤维，并且组装内的pi;电子部分的排列决定了电离离域纳米材料的形成然后通过延长的纤维缠结或通过另外的非共价相互作用形成原纤维 - 原纤维交联来诱导水凝胶。^11-14即使pi;-共轭肽类水凝胶作为模拟细胞外基质（ECM）的人造材料已经获得了越来越多的关注，由于分子间相互作用的瞬时和弱性质，超分子组装过程通常导致软水凝胶具有差的粘弹性，其不能提供必要的环境来引发细胞特异性功能。已经表明，支架和底物的机械性能可以直接影响细胞行为，包括细胞运动性，粘着斑和细胞生长。此外，微环境的机械性质影响细胞分化和吸收外源信号分子的能力。

目前为生物应用而努力构建基于肽的水凝胶依赖于通过化学或酶交联的机械调节。特别地，可以调整化学交联以改变软水凝胶的机械性能，同时通过提供用物理或生物线索功能化的能力来增强化学多样性。所得水凝胶的机械性能取决于纤维分支的程度和纤维之间交联的类型和强度。化学交联通过连接特定功能部分的反应性末端，将肽或其所得纳米材料之间的非共价相互作用转化为共价键。然而，凝胶形成依赖于分子间反应的程度，并且分子内反应可能会分散凝胶形成。最近，生物兼容的“点击化学物质”已被用于交联应用，其易于使用和在温和的细胞相容性条件下有效，高选择性的反应。包括自由基引发的硫醇 - 烯和硫醇 - 炔，Cu（I） - 催化的叠氮炔 - 环加成（CuACC）和应变促进的叠氮炔 - 炔炔环加成（SPACC）的点击化学被广泛地用于形成 的交叉链接。

在本文中，我们设计了八个肽 - 发色团 - 肽三嵌段肽，其显示特定的功能部分，其可以选择性地与适当修饰的小的基于PEG的客体分子反应以实现网络交联。具体来说，我们研究了几种不同的交联反应（胺反应性交联，叠氮炔环加成，硫醇 - 烯反应和酶交联）对所得水凝胶的体积流变性质的影响。这些反应可以通过各种外部物理刺激（例如超声和光激发）触发。已经发现共价和非共价相互作用的共存对这些pi;共轭物的自组装和水凝胶化产生了很大的影响，而肽段中对氨基酸的各种侧链修饰提供了一个方便的手柄来调节粘弹性 所得水凝胶的性质。此外，合成了用层粘连蛋白衍生的Ile-Lys-Val-Ala-Val（IKVAV）和纤连蛋白衍生的Arg-Gly-Asp（RGD）修饰的pi;-缀合物以赋予特定的生物学活性。将人神经干细胞接种在由RGD和IKVAV衍生的肽pi;缀合物形成的水凝胶上，并评估了这些表位对神经分化的影响。IKVAV修饰的交联pi;-缀合物显示增强的神经元分化能力，而RGD肽水凝胶不能支持hNSC。这些交联pi;共轭体的细胞研究提供了一些见解，为将来合理的设计策略提供有益的光电相关生物材料的构建。

■结果与讨论

自组装的基于肽的水凝胶是水溶胀的三维原纤维网络，其与原纤维 - 原纤维缠结，支化或化学交联连接在一起。衍生自物理交联或弱非共价相互作用的超分子水凝胶本质上是动态的，并且易受机械力的剪切。然而，共价交联是可以进一步调节所得材料的永久性连接。在这里，我们说明了使用双组分系统（特别是官能化肽和PEG交联剂）形成新的pi;-共轭肽水凝胶，其使得可调谐力学形成水凝胶。 选择PEG是由于其生物相容性，亲水性和易于修饰的各种官能团，如硫醇，叠氮化物和胺。

图1.（a）OT4-肽（DXVVX和DXFFX）的化学结构。 （b）空间填充能量最小化模型，说明DXFFX可能的装配结构（俯视图）。 pi;共轭片段（四元噻吩）为黄色。

设计与合成： 在这里，我们研究了基于完善的四噻吩（OT4）发色团作为pi;电子单元具有pH依赖性组装的肽-pi;-肽三嵌段分子。根据我们以前的研究设计了肽，使得pi;电子单元侧面是两个肽序列，其中N至C肽极性从pi;电子单元向外延伸。除非另有说明，否则这里的肽序列由去质子化天冬氨酸（Asp，D）残基引入的静电排斥设计为在碱性pH约 10下是可溶的。在较高的pH值下，这些静电排斥阻碍了自组装，并且降低溶液pH（ca.pH 2）可以筛选这些排斥（通过羧化物中和），并通过使分子内氢键和其他有利的焓相互作用促进装配过程。疏水和pi;-pi;相互作用也是自组装中的重要决定因素。在肽设计中，考虑了pi;-pi;相互作用对疏水相互作用的相对贡献。缬氨酸（Val，V）是一种具有高beta;-折叠倾向的beta;-支链氨基酸，被选为原型疏水性序列，苯丙氨酸（Phe，F）掺入也通过疏水性采用beta;-二级结构， pi;-pi;相互作用。将众所周知的自组装“Phe-Phe”基序嵌入肽序列中以进一步提高组装倾向。

使用标准固相肽合成（SPPS）手动合成三嵌段肽。 通过固相酰胺化和Pd催化条件提供OT4发色团附着物以引发四噻吩二酸和胺封端的树脂结合肽之间的二聚。通过掺入结氨酸和苯丙氨酸来合成图1a所示的肽，以促进在水溶液中的组装，用X表示的位置处的反应性官能团提供反应性交联的位置。我们合成了8种不同的通式DXVVX-OT4-XVVXD和DXFFX-OT4-XFFXD（其中X = Lys（K），扩增Gly（Gp），Lys（Alloc）（K（Alloc））， 和Gln（Q），所有已知的化学和酶交换反应参与者）。

自组装：肽-pi;-肽三嵌段在酸性和碱性条件下的自组装进行了详细的评估。除非另有说明（例如，对于在碱性pH下组装的DKXXK肽），这些三嵌段肽在碱性pHge;8下表现出分子溶解状态，而在酸性pH下，肽组装成1D纳米结构。在DKFFK的空间填充能量最小化模型（图1b）中，pi;-缀合的肽被组织成理想的取向。这种对准有利于沿着原纤维轴线的酰胺官能团之间的氢键网络并且促使pi;单元之间略微滑动的共面相互作用。

图2. DGpVVGp和DGpFFGP肽的代表性溶液光谱：DGpVVGp（a）和DGpFFGp（c）的UV-vis和PL（lambda;exc= 410nm）; DGpVVGp（b）和DGpFFGp（d）在碱性pH（虚线曲线）和酸性pH（实心曲线）下的CD光谱。

在这些衍生物的水凝胶中观察到的原纤维可能由两个或更多个单元的束组成。 使用紫外可见分光光度计光致发光（PL）和圆二色性（CD）光谱在稀释条件（〜10 -6 M）中光谱地监测组装的pi;-缀合的肽以探测组装材料的比较电子结构。 在组装状态下，光致发光的吸收和淬灭的蓝移表示发色团亚基的H样聚集。图2中显示了DGpVVGp和DGPFFGP肽的代表性光物理学表征。 图2a，c中所示的发射曲线显示了淬灭作为溶液pH的函数的不同程度。 在单体和组装状态下也获得了每种肽的CD光谱（图S15）在这里，我们分析了可见光（550-400nm）和UV区域（远紫外线（240-180nm）和近紫外（400-260nm））的自组装材料的吸收。单体肽状态的CD光谱显示扩展的基线响应，而组装状态显示在肽的吸收最大值附近具有交叉（椭圆率为0）的特征双峰棉花带（图2和S15）。在组装的肽溶液中发现的这种激子耦合棉花带表明在氢键合网络内局部手性环境中存在OT4发色团。如前所述。棉花效应的强度和迹象是由于组装倾向和发色团之间的相互作用程度的变化而急剧变化。然而，高能酰胺键区域中的特征CD信号表明形成beta;-片状结构（最小为216nm）。 其中CD信号的反转被认为源自原纤维超分子手性的变化。除非另有说明，用于交联反应的pi;-肽共轭物溶解在无缓冲水中并混合（涡旋）以获得光学上透明的均匀溶液。 由于肽纯化的残留缓冲液，这些溶液的pH值为〜6〜8。本研究使用了在间隔臂两端具有相同活性基团的双官能交联剂。通过TEM和CD溶解在无缓冲水中立即分析肽溶液，数据表明肽已经组装在无缓冲水中（图S16a，b）。

图3.（a）说明在自组装的原纤维上下文中Lys侧链的潜在相对取向的模型。 （b）氨基取代的交联剂。

图4.用交联剂A处理后DKVVK（a，b）和DKFFK（c，d）水凝胶的应变扫描（a，c）和振荡频率扫描（b，d）

除非另有说明，否则用于交联反应的pi;-肽缀合物溶解在未缓冲的水中并混合（涡旋）以获得光学透明的均匀溶液。由于来自肽纯化的残余缓冲液，这些溶液显示出~6-8的pH值。 在间隔臂的任一端具有相同反应基团的双功能交联剂用于该研究。 通过TEM和CD在非缓冲水中溶解后立即分析肽溶液，并且数据强烈表明肽已经在未缓冲的水中组装（图S16a，b）。然而，这些可预期组装的pi;-肽缀合物在无缓冲水中的光学透明的1重量％溶液不能形成自支撑水凝胶（图S16c）。

胺交联反应：我们研究了简单的胺基共价交联以增强超分子肽水凝胶的粘弹性。N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化酯广泛应用于交联方法。通常，NHS酯与亲核试剂反应以释放NHS或磺基-NHS基团以在伯胺或仲胺之间产生稳定的酰胺或酰亚胺键。许多NHS酯不溶于水性缓冲液，因此有必要以高浓度将它们溶解在有机溶剂如DMSO或DMF中，使得只有最小体积被递送到水性反应介质中。相反，我们使用具有7.7Aring;间隔臂的同功能的水溶性磺基-NHS酯A，双（磺基琥珀酰亚胺基）戊二酸酯（BS2G）37和带有11.4Aring;间隔臂的B，双（磺基琥珀酰亚胺基）辛二酸酯（BS3）37， 用于交联研究（图3）。在生理pH条件下，这些交联剂与赖氨酸侧链的游离ε-氨基反应形成稳定的酰胺键。室温下，在HEPES缓冲液中进行了交联反应。 将反应性DKVVK和DKFFK肽溶解在HEPES中，得到1重量％的肽溶液，其在室温下用HEPES中的A（10mol％）或B（10mol％）交联剂处理，然后轻轻移液管混合，得到交叉连接的肽材料（表S4）。NHS酯的水解与伯胺的交联反应相竞争。交联DKVVK和DKFFK肽的自组装和水凝胶化表明与交联剂A和B的间隔臂长度直接相关的交联反应中的一些有趣的趋势（表S4）。在DKFFK的简化包装模型中，肽带组件将Lys残基暴露于溶剂。这意味着这些悬浮的残留物可以介导细胞内和原纤维共价交联，确定原纤维交联度和水凝胶强度。序列疏水性明显地影响导致原纤维自组装的早期分子识别事件，而氨基酸变异诱导形态学变化，其显著影响这些系统的超分子行为。通过用0.2％应变的振荡频率扫描测量与A交联的水凝胶的流变强度（图4）。对于线性粘弹性区域中的每个交联水凝胶，测定储能模量（G）和损耗模量（G“）。DKFFK的G和G“分别为〜99000plusmn;11 500 Pa和〜14 000plusmn;1700 Pa，DKVVK的G和G”分别为〜31 000plusmn;4000 Pa和4000plusmn;500 Pa。两种水凝胶都显示与频率无关的G和G“值，与刚性水凝胶形成一致。观察到由DKVVK与DKFFK形成的凝胶的刚度的差异可归因于肽的可变组装倾向及其有效原纤交联密度。这些结果表明，芳族侧链与官能团转化之间的互补pi;-pi;相互作用在组装中起作用。使用交联剂B不会导致形成自支撑凝胶，因此不记录流变学测量。我们尝试使用电喷雾电离光谱法（ESI）来确定DKVVK与接头A的交联产物，作为交联效率的量度（图S17）。根据ESI碎片模式，交联的DKVVK显示延伸至五聚体的低聚物分布。

图4.用交联剂A处理后DKVVK（a，b）和DKFFK（c，d）水凝胶的应变扫描（a，c）和振荡频率扫描（b，d）。

使用负染色的TEM成像来观察所得原纤维形态的内部结构。DKFFK与A和B交联剂形成刚性纤维（图S18）。然而，DKFFK相对于交联剂的类型显示出不同的形态学变化。与A的交联似乎形成直径为5.1plusmn;1.6nm的较小原纤维束（与宽度上的一个肽上的原纤维大致一致），而与B的交联似乎形成直径为6.5plusmn;1.8nm的更宽的原纤维。具有交联剂A的DKVVK显示宽8.0plusmn;1.0nm的广泛原纤维束的存在; 然而，使用交联剂B，它似乎不形成任何原纤维组件（图S18）。预期原纤维尺寸的变化趋势是由于取决于交联剂的间隔臂长度的原纤维 - 原纤维交联的变化。

Cu（I）-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition Cross-Linking Reactions。 Cu（I）催化的叠氮炔环加成交联反应Cu

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