一种基于香豆素用于检测苯硫酚的荧光探针的合成及应用外文翻译资料

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一种基于香豆素用于检测苯硫酚的荧光探针的合成及应用

Jun Li,dagger;,sect; Chun-Fang Zhang,dagger;,sect; Shu-Hou Yang,dagger; Wen-Chao Yang,*,dagger; and Guang-Fu Yang*,dagger;,Dagger;
dagger;Key Laboratory of Pesticide amp; Chemical Biology of Ministry of Education, College of Chemistry, Central China Normal University,Wuhan 430079, P.R. China

Dagger;Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering, Tianjin 30071, P.R. China

摘要：由于苯硫酚及其衍生物在环境中的的剧毒性，开发能够检测苯硫酚的荧光探针具有重要意义。在目前的研究中，我们合理设计了一种通过分子内电荷转移机理来检测苯硫酚的荧光探针。设计出荧光探针在脂肪硫醇中对苯硫酚具有出色的选择性和灵敏度。（荧光探针与苯硫酚结合后）出现了很大的（145nm）的斯托克斯位移，并且荧光强度增强了280倍以上。此外，这种新型的荧光探针不仅在HEK293细胞中具有很好的通透性，而且在定量测量水样中苯硫酚实验中具有90%以上的回收率，因此该新型荧光探针作为检测苯硫酚的传感器在环境和生命科学中具有广阔的应用前景。

苯硫酚又叫苯硫醇，在有机合成、制备农用化学品，药物和各种工业产品中具有广泛的应用。然而苯硫醇比脂肪硫醇毒性要大很多；在鱼类中，苯硫酚的半数致死量LC50为0.4mmol^[1-3]。除此之外，长期暴露在苯硫酚中会造成一系列健康问题，包括中央神经系统损伤，呼吸、肌肉衰退，后肢麻痹，昏迷甚至死亡。因此一种简单高效的检测苯硫酚的方法就显得尤为重要了。

随着荧光探针技术对指定化合物的检测技术的发展，这一领域引起了科研工作者的广泛的兴趣。这种类型的探针能够可靠的显示生物体内目标物的含量水平^[4-10]。由wang课题组报道的的第一个苯硫酚探针的机理是分子内电荷转移，其中4-氨基-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑基是作为荧光团^[11]。虽然这种荧光探针具有很好的水溶性和选择性，但是荧光量子产率很低（phi;=0.02）。最近，已经通过ICT或PET过程开发出了一些新的苯硫酚荧光探针^[12-18]。在这些已经报道出的苯硫酚荧光探针中，一些探针的荧光强度很弱，一些探针需要一些有机基团作为共溶剂，还有一些需要高pH环境的测试条件，只有极少数的探针能够用于环境中、生物样品中的苯硫酚含量检测。因此还是需要应用型的苯硫酚荧光探针。现阶段我们研发出了一种以ICT机理的，高选择性、高灵敏度的苯硫酚荧光探针。这种荧光探针具有以下优点：1、比其它报道的荧光探针具有更大的斯托克斯位移（145nm）；2、在溶液中，有超过280倍的荧光增强；3、在活细胞样品和液体样品中，相容性比较好。

香豆素是最好的荧光团，香豆素类化合物由于高荧光强度、卓越的溶解性、很好的细胞相容性和易制备等优点，是有潜力的荧光探针起始材料^[19-25]。因此我们设计出了一个以香豆素为基础苯硫酚荧光探针化合物1，其荧光机理是ICT，具体过程参见步骤1。在该化合物中，7-位上连有强电子给予基团—N，N-二乙基，在3-位上连有2,4-二硝基苯磺酰胺吸电子基团，两种基团共同作用，形成电子推拉体系来淬灭荧光团的荧光。我们也设想，在生理环境下，由于苯硫酚与脂肪醇与磺酰胺的反应常数不同，分别为pKa=6.5和pKa=8.5，磺酰胺轻易的被苯硫酚分解，而不能被脂肪醇分解。为了探究我们设想的正确性，我们合成了探针1，并且在纯水系统中研究其苯硫酚检测性能。

实验部分

器材和化学品 文章中除非另有说明，所有试剂都可以购买，并且按常规标准处理，柱层析硅胶柱所用的硅胶为200-300目，所用溶剂采用常规方法进行干燥

方案1 检测苯硫酚荧光探针示意图

和双蒸。1H NMR和13C NMR所用溶剂分别为CDCl3和DMSO-d6或者CD3CN-d3，检测器为Varian Mercury 600或400光谱仪。delta;是相对TMS的百万分之一。以下缩写用于表示化学位移多重性：s=singlet,d=doublet,t=triplet,m=multiplet,and br=broad。在WATERS MALDI SYNAPT G2HDMS (MA, USA)采用积极模式以获取高分辨质谱。熔点在Buchi B-545熔点仪上测得（未校正）。采用文献报道的方法合成化合物M1和M2^[26]。

中间体和探针1的合成 7-二乙基氨基-3-硝基 - 色烯-2-酮（M1）的合成。将3.86g（20mmol）4-二乙基氨基 - 水杨醛、2.93g（22mmol）乙基硝基乙酸酯和0.6mL的冰醋酸溶于50mL正丁醇中，加热回流24小时。冷却过程中会形成橙色固体。所得产物用正丁醇和石油醚（2times;10mL）清洗，再放入真空干燥箱中干燥，最后得到3.18g橙色固体。产率：61%；熔点：198-199℃；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): delta; 9.03 (s, 1H), 7.74(d, J = 9.2 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.64 (s, 1H), 3.54(q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.16 (t, J = 7.2 Hz, 6H). 13C NMR (100MHz, DMSO-d6): delta; 158.28, 156.98, 154.42, 143.86, 133.21,125.90, 111.29, 106.03, 96.01, 44.66, 12.25。HRMS计算值[M Na ]：285.0851。测定值：285.0836。

3-氨基-7-二乙氨基 - 苯并吡喃-2-酮（M2）的合成。在100mL的圆底烧瓶中加入19.4g（85.81mmol）的SnCl₂·2H₂O和60mL37%的HCl，再分批加入3.0g（11.45mmol）化合物M1，将所得溶液在室温下搅拌6h。然后，加入6mol/L的氢氧化钠溶液中和过量的酸，再用乙酸乙酯对产物进行萃取。有机层用无水硫酸钠干燥，并将干燥后的有机层溶剂蒸发干。然后得到粗产物（1.57g），为棕色固体。产率：59%；熔点：81-892℃；1H NMR(600 MHz, DMSO-d6): delta; 7.20 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.70 (s,1H), 6.61 (d, J1 = J2 = 2.4 Hz, 1H), 6.50 (s, 1H), 5.07 (s, 2H),3.35 (q, J = 6.6 Hz, 4H), 1.09 (t, J = 7.2 Hz, 6H). 13C NMR(100 MHz, CD3CN-d3): delta; 160.73, 152.11, 147.88, 129.33,126.82, 113.39, 110.85, 110.18, 98.37, 45.07, 12.65。HRMS 计算值[M Na ]: 255.1109。实验值: 255.1095。

N-（7-（二乙基氨基）-2-氧代-2H-色烯-3-基）-2,4-二硝基苯磺酰胺（化合物1）的合成 将6mL含有319mg（1.2mm）2,4-二硝基苯硫氯的二氯甲烷溶液缓慢滴加到3-氨基-7-二乙基氨基 - 色烯-2-酮溶液中（232mg，1mmol3-氨基-7-二乙基氨基 - 色烯-2-酮和101mg，1mmol的三乙基胺溶于10mL二氯甲烷所形成的溶液中）。混合物在室温下搅拌过夜，待反应完成，产物用50mL水和饱和食盐水洗涤，在用无水硫酸钠干燥。减压除去溶剂后，残余物通过快速柱色谱纯化，得到标题化合物（138mg），为红色固体。产率：30%。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): delta;10.58 (s, 1H), 8.87 (s, 1H), 8.64 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.31 (d, J= 8.4 Hz, 1H), 7.83 (s, 1H), 7.50 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.74 (d, J= 8.8 Hz, 1H), 6.50 (s, 1H), 3.42 (q, J = 6.4 Hz, 4H), 1.11 (t, J= 6.0 Hz, 6H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): delta; 159.12,154.99, 150.64, 149.70, 147.33, 140.22, 137.83, 132.02, 129.70,126.83, 119.62, 114.01, 109.35, 107.07, 96.28, 43.99, 12.18。HRMS计算值[M K ]：501.0482，实验值：501.0480。

探针1与苯硫酚的反应。将50mg（0.11mmol）探针1溶于5mLDMSO-PBS（1:1，V/V pH 7.4）溶液中，将20mg（0.17mmol）苯硫酚加入上述溶液中。在50℃下搅拌过夜后，自然冷却，用水洗涤，再用二氯甲烷萃取。有机层在减压条件下挥发，除去溶剂，粗产物通过快速柱色谱纯化，得到化合物2和3。

化合物2（3-氨基-7-二乙氨基 - 苯并吡喃-2-酮） ¹HNMR（400 MHz, CD₃CN-d₃): delta; 7.10 (d, J = 8.8 Hz, 1H),6.58 (s, 1H), 6.57 (dd, J1 = 2.8 Hz, J2 = 2.4 Hz, 1H), 6.47 (d, J= 2.4 Hz, 1H), 4.16 (s, 2H), 3.43 (q, J = 7.2 Hz, 4H), 1.08 (t, J= 7.2 Hz, 6H). 13C NMR (100 MHz, CD3CN-d3): delta; 160.86,152.30, 148.25, 129.47, 126.93, 113.51, 110.95, 110.35, 98.64,45.14, 12.77。

化合物3（（2,4-二硝基苯基）（苯基）硫烷） ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃): delta; 9.12 (s, 1H), 8.13 (d, J = 6.8Hz, 1H), 7.60 (m, 5H), 6.99 (d, J = 9.2 Hz, 1H). 13C NMR(100 MHz, CDCl3): delta; 148.35, 144.31, 143.87, 135.91, 131.09,130.71, 129.06, 128.81, 126.85, 121.44。

量子产率的测定 荧光量子产率的计算是通过比较与参考物的校正积分面积来获得的。使用荧光素（phi;=0.98,0.1mol/L氢氧化钠）作为参考物，将探针1溶于pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液，使其浓度为1mol/L，并且进一步稀释到在370nm波长的光照下吸光度小于0.05的最大浓度，然后测定其紫外-可见吸收光谱，并且同时测量相应的荧光发射波长。在用阿贝折射仪校正不同溶剂的折射率后，用方程1计算量子产率。

活细胞成像和细胞毒性研究 人体胚胎（HEK293）细胞培养在加了10%（V/V）胎牛血清和1%（V/V）100mM丙酮酸钠的DMEM中。将细胞接种在24孔板培养基上，并在37℃和5%CO2下孵育过夜。然后，将溶解在含有0.1%（V/V）DMSO的培养基中的探针1（20mu;M）加入细胞中，将细胞在37℃下培养30分钟。作为对照实验，将细胞用PBS或N-甲基马来酰亚胺（NMM，500uM的PBS溶液预处理1小时。然后将样品细胞洗涤三次以除去残余的NMM，随后在含有0.1%（V/V）DMSO的培养基中用探针1（20uM）处理。用20倍物镜的倒置荧光显微镜（Olympus IX71，Japan）对实验组细胞和对照组细胞进行成像。

为了研究细胞毒性，细胞以1times;10⁵个细胞/孔接种在24孔板中，并在处理前孵育24小时，然后将细胞暴露在不同浓度（2-50uM）的探针1中24h。为了测定细胞活力，使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-3,5-二苯基四唑溴化物（MTT）的比色代谢活性测定然后将细胞样品与MTT溶液（含有5mg / mL MTT试剂的PBS）一起孵育4小时，在除去MTT溶液后，加入二甲基亚砜以溶解晶体。使用酶标仪在540nm测量吸光度(SpectraMax M5, Molecular Devices)。每个实验至少做三次。细胞毒性以实验组和对照组的细胞吸光度比率来评定。

水样中苯硫酚的检测 考虑到其他样品中可能的干扰，水样中的苯硫酚含量采用文献中报道的标准加入法测量^[12][16][27]。在测量试样之前，先

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