发展和验证稳定性指示方法：使用RP-HPLC方法同时评价头孢克肟和双氯西林质量外文翻译资料

ScienceDirect发展和验证稳定性指示方法：使用RP-HPLC方法同时评价头孢克肟和双氯西林质量

原文作者 Somnath D. Bhinge^a,lowast;, Sharangouda M. Malipatil^b

单位 ^aRajarambapu College of Pharmacy, Kasegaon, Dist – Sangli 415404, Maharashtra, India

^bMatoshri Taradevi Rampure Institute of Pharmaceutical Sciences, Kalburgi 585105, Karnataka, India

摘要：一种简单、快速、稳定的稳定性指示RP-HPLC方法，以便在单一波长（225nm）下测量头孢克肟和双氯西林，使用Capcell Pak C18DDS5柱（4.6mmtimes;250mm，粒径5mu;m），用磷酸盐缓冲溶液（用正磷酸将其PH调至5.4）：乙腈：甲醇(42:55:03, v/v/v)作为流动相等度洗脱，流速为1.0mL/min。在0.5至25mu;g/ mL的范围内呈了良好线性。发现头孢克肟和双氯西林的检测限分别是0.020和0.018mu;g/ mL，定量限分别是0.315和0.205mu;g/ mL。该方法根据标准准则在线性、精密度、准确度（重复）、特异性和稳定性方面进行了量化的评价。该方法可以简单、方便，适合头孢克肟和双氯西林的大批量和制剂分析。

关键词：稳定性指示方法RP-HPLC； 头孢克肟； 双氯西林； 验证

1.介绍

头孢克肟（CFX)的化学名称为：（6R，7R）-7 7-[[2-（2-氨基-1,3-噻唑-4-基）-2-（羧基甲氧基亚氨基）乙酰基]氨基]-3-乙烯基-8 - 氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸.如图1所示。对于各种病原体，特别是革兰氏阴性菌。当口服治疗易感性感染如脑膜炎，中耳炎，咽炎，下呼吸道感染和尿道感染时，它有广泛且有效的活性。

双氯西林（DLX)的化学名称为：（2S，5R，6R）-6 - [[3-（2,6-二氯苯基）-5-甲基-1,2-噁唑-4-羰基]氨基] -7-氧代-4-硫杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚烷-2-羧酸，如图1所示。它用来治疗易感性革兰氏阳性菌。联合用药可以用来治疗多种细菌感染。

据文献报道，已经有了几种分析头孢克肟和双氯西林作为单一组分或与其他药物（作为制剂和生物样品）组合的分析方法。但是，很少有方法在生物样品中同时分析复方制剂中的头孢克肟和双氯西林与在生物体液中的其他抗生素一样作为单一药物被描述。文献提及到用UV–VIS, HPLC, LC–MS, LC–MS–MS和HPTLC来单独测定头孢克肟和双氯西林或者与其他药物的复方制剂（作为制剂和在生物样本中）.另外，现存的分析方法在溶剂消耗和运行时间方面不是很有效率，因此进行了本研究。据全面的调查文献显示，没有一个最受认可的药学期刊涵盖同时测定这些复方制剂头孢克肟和双氯西林的方法，而且关于药物的稳定性的信息并不可靠。因此，似乎有必要发展一种液相色谱的方法作为一种可靠、准确、稳定性指示的HPLC方法用来同时测定片剂中的头孢克肟和双氯西林。本研究的目的是建立一种简单、快速，稳定性指示方法反相高效液相色谱法用来同时分析片剂中的头孢克肟和双氯西林。

2.实验

2.1化学试剂

所有的试剂和溶剂均为分析纯；它们包括购自Merck Ltd.，Mumbai，India的盐酸，磷酸二氢钠，磷酸二氢钾，乙酸钠三水合物，正磷酸和甲醇。使用微孔滤过膜和Milli-Q（Bedford，MA，USA）纯化系统获得高纯度去离子水。头孢克肟，双氯西林（Blok Pharma Pvt.Ltd，Kolha-pur），乙腈（Merck Chemicals）和所有使用的其它化学品均为分析纯。双蒸水用于制备流动相溶液。含有头孢克肟和双氯西林的片剂（商品名：Hifen-LXX 200）从Atpadi，Maharashtra（India）的当地市场购得。 0.45-1m尼龙过滤器购自高级微设备公司，印度昌迪加尔。

2.2仪器

使用具有LC-P-100泵，LC-UV 100可变波长可编程UV / Vis检测器的Cyberlab-chrom-HPLC V 4.0等度高压液相色谱仪（Cyberlabs，USA）和Cyberstore version4-0512-039，通过反相Capcell Pak C18DDS5柱（4.6mmtimes;250mm，粒径5mu;m）进行色谱分离。

2.3色谱条件

将由5mM磷酸盐缓冲液（pH 5.4）：乙腈：甲醇（42:55:03，v / v / v）组成的流动相脱气，并使用配有以下物质的Millipore真空过滤系统过滤： 0.45mu;m膜过滤器。 通过在环境温度下以1.0 mL/min的流速泵送流动相进行色谱法。在225nm处监控流出柱。

2.4储备液的制备

将精确称量的头孢克肟和双氯西林（10mg）转移到10.0ml容量瓶中。然后，加入少量流动相，超声处理5分钟，用流动相稀释至刻度，得到最终浓度为1000mu;g mL-1。

2.5标准溶液制备

从头孢克肟和双氯西林储备溶液中，通过移液将1ml转移到10ml容量瓶中，用流动相补足最终体积，使最终浓度为100mu;g/ mL。

2.6制备样品溶液

称量20片片剂（Hifen-LXX 200）的粉末，每片含200mg头孢克肟和500mg 双氯西林。 将相当于10mg 头孢克肟和25mg 双氯西林的一定量的粉末分别置于几个10mL容量瓶中，所述容量瓶含有约5mL的流动相用于分析，并且将结果超声处理15分钟。 超声处理后，使用相同的溶液使体积达到标记，以获得头孢克肟（1000mu;g/ mL-1）和双氯西林（2500mu;g/ mL）的样品储备溶液。 然后，使用0.45mu;m膜过滤器过滤溶液。 将滤液（0.010mL）定量转移至10mL容量瓶中，使得头孢克肟的最终浓度为10mu;g/ mL，双氯西林为25mu;g/ mL。

2.7方法验证

发现当前手稿中描述的色谱条件适合于定量测定。在分析条件已经优化之后，评估了线性，精确度，准确度（回收率），专属性和稳定性等某些参数以验证该方法。

2.7.1系统适用性测试

系统适应性测试根据USP 24 / NF 19进行，以确认设备的重现性足以用于分析。在每批样品的分析之前进行测试以确保色谱系统的重现性。所选择的标准基于在其验证期间确定的方法的实际性能。这些参数包括保留时间，拖尾因子，理论塔板和注射的六次重复的不对称性的相对标准相对偏差（％RSD）。

2.7.2线性

使用六种浓度的头孢克肟和双氯西林来研究线性：0.5,1,5,10,15,20和25mu;g/ mL。线性实验进行六次，以确保检测器对于不同的药物浓度的响应都是是线性的。（0.5-25mu;g/mL）。通过添加具有不同浓度的头孢克肟和双氯西林溶液来制备所需浓度范围内的标准溶液;然后将溶液注入HPLC系统。通过绘制头孢克肟和双绿西林的峰面积对浓度的曲线构建标准曲线，并确定回归方程。

2.7.3准确度（%回收率）

通常可以提高HPLC方法的精密度和准确度，这也校正了检测器响应的波动。使用标准添加法进行准确度的研究。分别用额外的0,50,100和150％的标准头孢克肟和双氯西林溶液掺加头孢克肟（2.00mu;g/ mL）和双氯西林（5.00mu;g/ mL）的预量化样品溶液。使用这个方法分析这些混合物。 实验进行6次。 计算每个浓度的样品的回收百分率，％RSD和百分比。

2.7.4精密度

三个不同浓度（0.5，15和25mu;g/ mL）的头孢克肟和双氯西林的在三天每日三次测定日内和日间精密度，以获得相对标准偏差（％RSD）。

2.7.5检测限和定量限

在ICH指南中描述了几种用于确定检测（LOD）和定量（LOQ）限度的方法。 在本研究中，根据ICH指南，LOD和LOQ是基于响应值的标准偏差和使用信噪比的斜率确定的。

2.7.6稳定性

测量本方法的稳定性以评价色谱条件中小的但有意的变化的影响。 该方法的稳定性通过改变流动相的流速（0.9和1.1 mL/min），和流动相中的磷酸盐缓冲液的pH（5.3和5.5）和磷酸盐缓冲液的量（41％和43％）来测定。

2.7.7 专属性

通过比较标准品，样品和相应的空白制剂获得的色谱来验证专属性。

2.8加速降解

题为“新药物物质和产品的稳定性测试”的人用药物注册技术要求国际协调会议（ICH）指南要求进行加速试验以阐明活性物质的固有稳定性特性。这项工作的目的是研究头孢克肟和双氯西林使用时的生物降解提出的方法

2.8.1在酸性条件下的水解

分别使用20mu;g/ mL和50mu;g/ mL的头孢克肟和双氯西林的储备溶液，5mL的储备溶液和1mL的0.1N HCl加入到10mL容量瓶中。 然后，将容量瓶在60-70◦C回流条件下保持4小时，并用0.1N NaOH和10mL稀释剂中和，分别得到10mu;g/ mL和25mu;g/ mL浓度的头孢克肟和双氯西林。将溶液冷却至室温，使用0.45mu;m注射器过滤器过滤，并置于HPLC系统的小瓶中。

2.8.2在碱性条件下的水解

分别使用20mu;g/ mL和50mu;g/ mL的头孢克肟和双氯西林的储备溶液，将5mL储备溶液和1mL的0.1N NaOH加入10mL容量瓶中。 然后，将容量瓶在60-70◦C回流条件下保持4小时，并用0.1N HCl中和。 然后，加入10mL稀释剂，分别获得10mu;g/ml和25mu;g/mL浓度的头孢克肟和双氯西林。将溶液冷却至室温，使用0.45mu;m注射器过滤器过滤，并置于HPLC系统的小瓶中。

2.8.3氧化降解

分别使用20mu;g/ mL和50mu;g/ mL的头孢克肟和双氯西林的储备溶液，将5mL的储备溶液和1mL的3％（w / v）的过氧化氢加入10mL容量瓶。 然后将容量瓶在60-70◦C回流条件下保持1小时，用稀释液加至刻度线，分别获得10mu;g/ml和25mu;g/mL浓度的头孢克肟和双氯西林。将溶液冷却至室温，使用0.45mu;m注射器过滤器过滤，并置于HPLC系统的小瓶中。

2.8.4热诱导降解

分别使用20mu;g/ mL和50mu;g/ mL的头孢克肟和双氯西林的储备溶液，将5mL的储备溶液加入到10mL容量瓶中。 然后，将容量瓶在60-70℃的热空气烘箱中保持24小时，用稀释液加至刻度线，分别获得10mu;g/ml和25mu;g/mL浓度的头孢克肟和双氯西林。将溶液冷却至室温，使用0.45mu;m注射器过滤器过滤，并置于HPLC系统的小瓶中。

2.8.5光降解

分别使用20mu;g/ mL和50mu;g/ mL的头孢克肟和双氯西林的储备溶液，将5mL储备溶液加入10mL容量瓶中。将样品转移到培养皿中并保持在光稳定室（UV灯200W h / m 2和可见光的120万ltimes;h）中7天。 然后，用稀释液加至刻度线，分别获得10mu;g/ml和25mu;g/mL浓度的头孢克肟和双氯西林。将溶液冷却至室温，使用0.45mu;m注射器过滤器过滤，并置于HPLC系统的小瓶中。

3.结果与讨论

为了优化RP-HPLC参数并达到良好的分离度和头孢克肟和双氯西林的峰形，测试了几种色谱条件。测试了几种不同组合物的流动相为了发现对药物有足够分离度的流动相。磷酸盐缓冲液比其他缓冲液有更高的灵敏度和选择性。使用甲醇和乙腈作为有机组分导致更高的灵敏度，但是改变流动相中甲醇和乙腈的量影响分离度和运行时间。改变流动相的pH可以导致差的峰形;因此，我们将正磷酸引入流动相中将缓冲液的pH调节至5.4。为了优化的流动相，由5mM磷酸盐缓冲液（pH5.4）：乙腈：甲醇（42:55:03，v / v / v）组成流动相。在225nm处监控流出柱。最佳进样体积是10mu;L。柱温保持在25℃（环境）。使用CapcellPak C18DDS5柱（4.6mmtimes;250mm，粒径为5mu;m）以其等度洗脱，流速为1mL/min。在所有分析运行中，头孢克肟和双氯西林保留时间分别约为2.85plusmn;0.06和3.98plusmn;0.07分钟（图2）。

3.1方法验证

3.1.1系统稳定性试验

本分析中使用的色谱系统必须符合系统适用性限值，才能开始样品分析。分别使用10 mg/mL和25 mg/mL的头孢克肟和双氯西林浓度评估主峰和降解产物的拖尾因子（T），理论塔板数（N），保留时间（RT）和不对称因子(As)。通常，至少要满足这些标准中的两个，以证明系统对于所提出的方法的适用性。一些测试使用新制标准溶液，其中包括药物化合物。药物头孢克肟和双氯西林的保留时间分别为2.8416plusmn;0.0116和3.9433plusmn;0.0136min。头孢克肟的不对称因子为0.7058plusmn;0.0227，双氯西林的不对称因子为0.9286plusmn;0.0459。药物化合物的六次重复进样的保留时间的变化导致头孢克肟的％RSD为0.4113％，双氯西林的RSD为0.30464％。系统适应性测试（表1）获得的结果满足USP和ICH的标准。

3.1.2专属性

没有杂质、赋形剂、添加剂的干扰。实际上，片剂中的添加剂不溶于流动相，而活性成分是可溶的。

3.1.3线性

用峰面积和吸收度对头孢克肟和双氯西林的浓度做线性回归。标准曲线在0.5至25mu;g/mL范围内呈

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