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石墨烯量子点的潜在细胞毒性的理论评价

原文作者： Lijun Liang，Zhe Kong，Zhengzhong Kang，Hongbo Wang，Li Zhang，Jia-Wei Shen

单位：College of Life Information Science and Instrument Engineering, Hangzhou Dianzi University, No. 1, Second Street, Jianggan District, Hangzhou, 310018, Peoplersquo;s Republic of China；

College of Materials and Environmental Engineering, Hangzhou Dianzi University, Hangzhou, No. 1, Second Street, Jianggan District, Hangzhou, 310018, Peoplersquo;s Republic of China；

Department of Chemistry, Zhejiang University, Zheda Road 38, Hangzhou, 310028, Peoplersquo;s Republic of China；

Division of Theoretical Chemistry and Biology, School of Biotechnology, KTH Royal Institute of Technology, SE-10691 Stockholm,Sweden；

College of Automation, Hangzhou Dianzi University, No. 1, Second Street, Jianggan District, Hangzhou 310018, Peoplersquo;s Republic of China；

Department of Chemistry, Zhejiang Sci-Tech University, No. 2, Second Street, Jianggan District, Hangzhou, 310012, Peoplersquo;s Republic of China；

School of Medicine, Hangzhou Normal University, Xuelin Street 16, Jianggan District, Hangzhou 310016, Peoplersquo;s Republic of China

摘要：由于独特的形态，超小的侧向尺寸和卓越的性能，石墨烯量子点（GQD）在许多应用，特别是在电化学生物传感器，生物成像，药物传递等领域具有巨大的潜力。近年来，其对人和动物细胞的生物安全性和潜在细胞毒性一直是越来越关注的问题。在本文中，通过分子动力学模拟评估GQD的潜在细胞毒性。我们的模拟表明小尺寸GQDs可以垂直地轻松渗透到脂质膜。在纳秒时间尺度上比GQD61大的GQD渗透进入脂质膜是相对困难的。小尺寸GQDs甚至会影响POPC膜的厚度。自由能计算显示GQD通过脂质膜渗透的自由能势垒可能随GQD尺寸的变化而大大改变。在高GQD浓度下，GQD分子可以在水中快速聚集，但在进入膜内部后解聚。此外，高浓度的GQD可以诱导脂质双层的结构性质和扩散性质的变化，并且它可以影响细胞信号转导。然而，具有相对小尺寸的GQD不足够大以机械损伤脂质膜。我们的研究结果表明小尺寸的GQD细胞毒性低，可能适合生物医学应用。

关键词：分子动力学模拟，石墨烯量子点，细胞毒性，脂质膜，膜破裂

1.引言 由于独特的电气和机械性能，石墨烯在过去几年中已经被广泛研究^[1-4]。虽然与石墨烯和氧化石墨烯具有相同的单原子分层图案，但是石墨烯量子点（GQD）的横向尺寸小于100nm^[5]。源自石墨烯和氧化石墨烯，GQD继承了石墨烯的许多独特的电气和机械性能^[6-8]。更有趣的是，由于丰富的表面官能度，量子约束和边缘效应，GQD显示了许多不同于石墨烯的新物理性质^[9]。这使得GQD在潜在应用，特别是在电化学生物传感器，生物成像，药物传递系统中具有巨大的前景^[10-13]。作为生物医学领域的一个有前途的材料，GQD近年来已经被广泛研究^[14]。Zhu等人指出GQD可以作为优良的生物成像剂。陈报道指出GQD可用于靶向癌症荧光成像，跟踪和检测药物传递^[15]。与石墨烯和氧化石墨烯下相比，GQD在体内体外生物成像和生物标记中表现出巨大的优势^[16-20]。

表一 本研究中执行的所有模拟的详细信息

图一 不同尺寸的石墨烯量子点： (a) GQD7, (b) GQD19, (c) GQD61, (d) GQD151, and (e) GQD275

为了实现GQD在生物医学领域的应用，评估和理解GQD的生物安全和细胞毒性的先决条件是关键必要的。在过去几年中，通过理论和实验研究广泛评价了石墨烯的细胞毒性。^[21-25]Akhavan组首次报道了石墨烯和石墨烯氧化物（GO）纳米壁对细菌的毒性^[26]。他们发现由肼还原的GO纳米壁比未还原的氧化石墨烯纳米壁对细菌更具毒性^[26]。范等人指出由于GO的极高的蛋白质吸附能力，GO与FBS温育^[27]。廖等人发现石墨烯片比哺乳动物成纤维细胞较不密集包装的氧化石墨烯更具破坏性。石墨烯的毒性取决于暴露环境（即是否发生聚集）和与细胞（即悬浮液与粘附细胞类型）^[22]相互作用的模式。最近的研究还揭示了石墨烯和GO对细菌如大肠杆菌具有严重细胞毒性的抗菌活性^[28]。此外，由于GO片材的氧化程度和表面化学不同，GO在一些实验中显示低细胞毒性，而在其他实验中显示高细胞毒性。^[29-30]这些研究大大增强了我们对石墨烯和GO的细胞毒性的理解。然而，值得注意的是，在大多数作品中，石墨烯和GO被聚乙二醇（PEG），蛋白质或其他材料修饰，用于细胞毒性和其他生物效应评估^[31-34]。 因此，GQD的细胞毒性不同于石墨烯和GO，评价原始GQD的细胞毒性很必要，也很关键。从Zhang的报告中可以看出，GQD的细胞毒性低于微米级GO，被认为是适合在生物医学领域应用^[37]。然而，GQD在分子水平的细胞摄取的机制仍然不清楚，这极大地限制了人们对GQD生物安全的理解和GQD在生物医学领域的实际应用。此外，不同大小和浓度的GQD对其跨膜的影响是不清楚的。

近年来，分子动力学（MD）模拟已被广泛应用于研究生物技术领域中的复杂问题。^[38-41]MD模拟可以提供通过脂质膜的纳米颗粒移位的原子细节，并且已经成功地用于研究来自其他组的石墨烯的细胞毒性^[42-45]。Wei等人发现发现石墨烯可以通过异常强的分子相互作用破坏蛋白质的结构和功能^[46]。 Tu等人揭示了石墨烯纳米片插入和从大肠杆菌膜中提取脂质的过程^[43]。Yan等人研究了树状聚合物样纳米颗粒的包裹过程和脂质膜对二维纳米材料的渗透，^[47-49]他们发现石墨烯片在膜包裹过程中经历了独特的自旋。在这项研究中，进行了一系列模拟来调查脂质膜的移位。本研究中执行的所有模拟的详细信息见表1。

2.计算细节

2.1. 系统设置

为了清楚和简洁，所有的GQD都是从原始石墨烯构建的，基于参考文献5，来自GO的GQD不考虑在本研究中。将石墨烯片设置在x-y平面中，如我们之前的工作中所述^[50-51]。一个碳原子是具有笛卡尔坐标（0,0,0）的中心原子。其他具有x² y² lt;R ²的碳原子作为GQD中的碳原子，R是GQD的半径。为了保持苯环的完整性，R从0.375变化到0.618到1.08到1.65到2.05nm。如图1所示，本研究中所有GQD的几何都是一个圆，GQD的定义是基于稠合苯环的数目。更具体地，它们是图1中的GQD7（a），GQD19（b），GQD61（c），GQD151（d）和GQD275（e）。具有不同尺寸的GQD的边缘首先被氢原子饱和。之后，所有GQD的结构由Gaussian 03优化^[52]。然后将优化的结构用作MD模拟中的GQD的初始结构。在所有MD模拟中，使用256个POPC脂质，每层具有128个脂质。通过在NPT集合中的20ns MD模拟来平衡POPC脂质膜，并且使用平衡的结构作为用于模拟GQD跨膜的初始结构。之后，将GQD置于POPC膜的顶部，距离为4.5nm（在z方向上从GQD的质量中心到POPC膜的质量中心）。然后将所有系统在具有10.0nmtimes;10.0nmtimes;12.0nm水箱的TIP3P水中溶剂化以消除任何潜在的周期性边界效应。

2.2.MD模拟

远离边缘的碳原子被分配中性电荷，如在我们以前的工作，而氢原子和连接的碳原子在GQD的部分电荷是 0.115e和-0.115e，如参考文献53所述。在MD模拟中，保持部分电荷固定不允许电荷重排和极化效应。POPC脂质膜的参数来自CHARMM27力场^[54]。水分子由TIP3P模型55表示，^[55]其被认为适合于CHARMM27力场。使用GROMACS-5.0.4以2fsplusmn;5的时间步长进行所有MD模拟^[56]。所有系统都经历了能量最小化和平衡。NPT系综模拟采用了由Berensdsen恒温器施加的310K的恒定温度和由半各向同性Parrinello-Rahman恒压器控制的1巴的压力。用于非键合范德华相互作用的切口通过开关函数设定，开始于1.0nm，并在1.2nm处达到零。通过粒子网格Ewald（PME）求和计算长距离静电相互作用，对于直接和互逆空间求和的分离，开口为1.2nm。在模拟期间使用LINCS算法约束所有键长度和涉及氢原子的所有角度。通过GROMACS工具和家庭脚本分析数据。

2.3.PMF计算

在无偏性MD模拟的结果的基础上，计算通过脂质膜的不同尺寸（GQD7，GQD19和GQD61）的GQD的跨膜自由能特征。通过使用反应坐标沿着z轴从-3.5开始到0.5nm的伞采样方法来确定^[57]。从转向分子动力学模拟的轨迹中提取具有不同反应配位的每个窗口。在每个系统中，设置宽度为0.04nm的100个等距窗口，并且使用1000kJ mol^-1nm^-2的谐波力常数来定位约束每个窗口中的离子。在每个窗口中进行5ns模拟，最后3ns用于分析。将偏置分布重新组合，并且使用加权直方图分析方法（WHAM）计算PMF^[58]。

3.结果与讨论

3.1.不同尺寸GQD的渗透

在我们的模拟中观察到具有不同尺寸的单个GQD的吸收过程。如图2所示，测量从GQD的质量中心到POPC脂质膜的质量中心之间的距离。在相对较小尺寸的系统（GQD7和GQD61）中，GQD转运到细胞膜中。GQD7和GQD61在约2.5ns之后进入POPC脂质膜。值得注意的是，具有小尺寸的GQD倾向于停留在距离脂质膜的中间1.0nm的位置处，而不在脂质膜的中间。GQD151和GQD275也可以在约2.5ns后被脂质膜吸收。虽然对脂质膜的吸收时间对于不同的GQD几乎相同，但是具有不同尺寸的GQD的进入过程是不同的。如图2所示，GQD151和GQD275保持吸附状态并且在脂质膜的顶部扩散直至模拟的100ns结束。这意味着GQD151和GQD275的渗透过程比GQD7和GQD19的渗透过程长得多。这些结果表明，GQD的大小对膜表面上GQD的吸收时间几乎没有影响;然而，GQD的大小可以极大地影响GQD通过脂质膜的渗透过程。更有趣的是，如图3a和b所示，GQD7和GQD61倾向于垂直渗透脂质膜。 以这种方式，它们可以通过脂质膜而较少破坏脂质膜的结构。同时，GQD7 / GQD61和脂质的疏水尾部之间的疏水相互作用可以以这种方式最大化。为了更好地解释这种现象，计算GQD的平面和脂质膜之间的角度并显示在图3e中。这里，角度定义在脂质膜的x-y平面和GQD的表面之间。在初始状态下，在所有系统中GQD和脂质膜之间的角度为0°。在模拟过程中，小尺寸（GQD7和GQD61）的GQD可以渗透到POPC膜中，GQD7 / GQD61和脂质膜之间的角度主要在45°到70°之间。在通过脂质膜的垂直移位的方式中，GQD的苯环可以更强烈地与脂质膜的疏水尾部中的-CH ₂ - 基团相互作用。它可以大大增强GQDs和POPC脂质膜之间的相互作用。然而，具有大尺寸（GQD151和GQD275）的GQD只能在脂质膜表面上吸收，并且这些GQD和脂质膜之间的角度在0°至10°的范围内。

图二 模拟时间函数中不同GQDs的质心与的脂质膜的质心之间的距离。绿色虚线表示POPC膜的上端的位置。

图三 在100ns后具有不同尺寸的GQD在膜上的MD模拟： (a) GQD7, (b) GQD61,

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