中药两头尖的质量控制及其毒性研究外文翻译资料

中药两头尖的质量控制及其毒性研究

摘要：

两头尖为毛苠科银莲花属多被银莲花的干燥根茎。属于有毒中药，具有祛风湿，消痈肿等功效，常用于风寒湿痹，四肢拘挛，骨节疼痛，臃肿溃烂等症。文献显示，巳从两头尖中分离出多种三萜皂苷类化合物，临床药理研究亦证明两头尖具有抗炎、抗肿瘤、抗惊厥、解热镇痛等作用。但是，两头尖药材质量控制标准方面的研究未见报道，以及对两头尖毒性的解析及相关的毒理研究未见详细的研究文献。为规范使用两头尖，保证临床的安全用药，及进一步开发此药材，也为其他毒性中药的研究提供借鉴。本文对两头尖的质量标准进行了系统的研究，对其毒性进行了初步的探索。

选取产自中国东北部11个批次两头尖药材饮片。首先，采用薄层色谱法进行定性分析，高效液相色谱法（测定饮片中竹节香附素A的含量，检测药材饮片是否符合《药典》（2010版）的规定。其次，利用、傅里叶变换红外光谱（及紫外光谱（分别建立两头尖提取液的指纹图谱。在建立两头尖指纹图谱时，利用标准化法处理数据，以消除量纲的影响。以标准化后的数据计算样品向量与单位向量的夹角余弦相似度costheta;。同时，以样品与对照品含量的百分比为校正因子，校正夹角余弦相似度，得到的H具有定量意义。此法评价的指纹图谱兼具有定性定量的综合评价功能。以三种指纹图谱的costheta;和H值为指标，采用SAS统计软件对样品进行聚类分析。最后，制备两头尖水提浸膏，以石油醚、氯仿、乙酸乙酯及正丁醇分别分级萃取两头尖水提浸青，采用SAS统计软件，以Bliss法计算两头尖水提浸膏的LD₅₀并对两头尖进行毒性分级。测定乙酸乙酯提取部位的LD₅₀，测定石油醚、氯仿及正丁醇提取部位的MTD。

定性实验结果显示，11批次两头尖样品的薄板在对照品竹节香附素A的相应位置显示斑点。含量测定结果显示，两头尖样品中竹节香附素A的含量均高于0.20%(按干燥品计），符合《药典》（2010版）规定。指纹图谱的色谱条件为：以乙腈及0.1%磷酸溶液为流动相，流动相洗脱梯度为：0-7min，乙腈47-80%；乙腈流速为1ml/min，检测波206nm，理论板数按竹节香附素峰计算应不低于4000。批次两头尖样品共确定8个共有峰，传统夹角余弦相似度costheta;均在以上，符合建立指纹图谱的要求。costheta;在0.115和0.951之间变化，在0.045和1.129之间变化，表明costheta;和H可以更显著的区分样品。样品S9的costheta;和H值最低，分别为0.115和0.045,S3的值最高，分别为0.951和1.129。FT-IR指纹图谱，扫描范围为1500-800cm^-1，样品的costheta;和H值,S5最高，S8最低。UV指纹图谱，扫描范围为210-400nm,S6样品的costheta;和H值最高，S11最低。采用统计软件对样品进行聚类分析，S4和S11首先被聚为一类；其次为S1和S6。S8与其它的样品距离最远。两头尖水提物小鼠灌胃毒性实验LD₅₀及其可信限95%,分别为104.50和95.45-115.29g生药/kg。按照法推算相当于人，说明在临床应用常用量为1-3g—般是安全的。按照中药毒性分级，两头尖介于“中毒”和“小毒”之间。石油醚、氯仿和正丁醇萃取部位小鼠最大耐受量实验，灌胃给药生药天14后小鼠未出现明显中毒症状，小鼠体重也无明显改变，与对照組比较无统计学差异。解剖后，肉眼观察其主要脏器，未发现明显异常，说明分别口服两头尖石油醚、氯仿和正丁醇萃取物1000g/kg对小鼠都无明显急毒性作用。乙酸乙酯萃取部位的LD₅₀及95%的可信限分别为604.81和537.99-673.57g生药/kg。

关鍵字：两头尖，质量控制，指纹图谱，毒性

第二章通过薄层色谱和高效液相色谱法测定Raddeanin

2.1介绍

Raddeanin A（RA），称为Raddcanin R3（图5），是从两头尖根茎分离的主要三萜皂苷之一。在中国药典（2010版）中，干燥根茎的RA含量应高于0.20％（g / g），我们使用薄层色谱法（TLC）进行定性分析和高效液相色谱（HPLC）进行定量分析。

2.2材料，化学品和试剂

2010年9月从中国东北部收集了11个A. raddeana根茎样品，并由杭州师范大学的王树林博士鉴定.高效液相色谱级的腈基腈和甲醇从霍尼韦尔(马斯基根,可美国)获得。去离子水由微孔滤膜净化系统（Mi I ford，MA，USA）制备。参考物质RA（纯度gt; 98％）由成都药业有限公司（中国成都）提供。磷酸为分析纯。在高效液相色谱分析中使用的溶液应当用0.22um膜过滤。氯仿，浓硫酸，醇醚和正丁醇甲醇购自北京兴国生物科技有限公司。硅胶G板（100mmtimes;100mm）购自中国山东青岛海阳化工有限公司。

2.3标准溶液的制备

精确称重参考化合物RA，混合并溶解在甲醇中，然后在4℃下储存，然后进行TLC和HPLC分析。储备溶液中参考化合物的浓度为1mg/ml。参考RA溶液应当溶解在HPLC级甲醇中，并且当用于高效液相色谱分析时用0.22um膜过滤。

2.4样品溶液的制备

在索式萃取器中用50mL甲醇萃取A.raddeana根茎（5g，超过50目）的粉末，加热3小时。将所得萃取物减压干燥，得到残余物。将残余物分散在10mL水中，用乙醚脱脂两次（分别为20mL，10mL），然后分别用水饱和的正丁醇（20mL，20mL，15mL，15mL，15mL）萃取）。将所得的提取物合并，并在减压下蒸发至干。将这些残余物溶解在甲醇中，并转移至玻璃塞的10-mL。并用甲醇补足体积。

2.5 A. raddeana根茎样品的薄层色谱分析

在硅胶G板上进行色谱法。将RA 2ul的样品提取物或标准溶液从板的边缘施加到板上。使用氯仿 - 甲醇 - 水（7：3：1，v / v）溶液底层作为显影剂。在室温（25℃）下显影后，用干燥器干燥。在用10％硫酸 - 乙醇溶液（v / v）着色后，将薄层色谱板在105℃下加热，直到斑点变得澄清。

2.6 A.raddeana根茎样品的高效液相色谱分析

2.6.1设备和色谱条件

通过使用岛津（日本京都）LC-20ADXR泵，CTO-20A柱温箱，SIL-20AXR自动进样器，SPD-20A 紫外检测器进行高效液相分析。在40℃使用Venusil MP C-18柱（250cmtimes;4.6mm，5mu;m圆锥大小，100A，Agela Technologies）。通过CBM-102色谱工作站（岛津）完成数据收集和整合。由乙腈-0.1％磷酸盐（v / v）组成的流动相以1.0mL / min递送。流动相在真空下通过0.22mu;m膜过滤器过滤并在使用前脱气。以下HPLC参数用于分析：注射体积，10mu;L;检测波长，206nm;柱温，40℃。梯度条件列于下表2.1中。通过RA计算理论塔板数，其不小于4000。

表2.1高效液相色谱梯度条件

时间(分钟) 流(毫升/分钟) 乙腈 0.1%磷酸缓冲液

最初 1 47 53

0-7 1 47 53

7-15 1 47-55 53-45

2.6.2校正曲线

根据色谱条件“2.5.1”，分别注入5,10,20,40和50ulRA参照溶液用于测量峰面积。样品的浓度设为横坐标（X）。峰面积设为纵坐标（Y）。因此，产生由“RA浓度（X）”对“峰面积（Y）”组成的标准曲线。样品中RA的浓度使用外标法计算。 RA的校准曲线是线性范围Y 348680X 59594，r 0.9999（图2.2）。在5-50的浓度范围内研究线性。

图2.2 Raddeanin的校准曲线

2.6.3检测限（LOD）和定量限（LOQ）

检测限（LOD）被测量为可以通过与空白的响应不同的响应（S / N 3，S / N是信号与噪声的比率）检测的分析物的最低量。 RA的LOD为0.01 ug/mL -1（0.05ng）。定量限（LOQ）被测量为可重复定量高于基线噪声（S / N 10）的分析物的最低量。 LOQ值为0.03ug/ mL （0.015ng），重复分析三次，发现的内容作为平均值加上或减去标准偏差。

2.6.4精密试验

精密度表示为相对标准偏差（RSD）。通过高效液相色谱连续分析相同的标准溶液6次，以在色谱条件“2.5.1”20 ul下测量RA峰面积，随后计算RA峰面积的RSD（表2.2）。

表2.2 Raddeanin峰值区域及其相对标准偏差的精度测试

次数 1 2 3 4 5 6 RSD/%

两头尖峰面积 7020269 7035472 7055046 6910248 7028106 7159164 1.13

2.6.5稳定性试验

通过高效液相色谱在色谱条件“2.5.1”在 0,2,4,8,12和24小时，每次20ul下分析相同的样品溶液。稳定性表示为RSD，RA峰面积的RSD为随后计算，结果表明样品溶液在24h时稳定（表2.3）。

表2.3Raddeanin峰值区域及其相对标准偏差的稳定性测试

2.6.6重复性试验

相同的样品溶液在色谱条件“2.5.1”下通过高效液相色谱分析6次，每次20ul。重复性表示为RSD，随后计算RA峰面积的RSD。结果表明样品溶液的重现性良好（表2.4）。

表2.4 Raddeanin峰值区域及其相对标准偏差的再现性测试

2.6.7恢复试验

将相同的6份样品（5g，超过50目）精确称重并与RA参照物质分别混合，并使用方法项目“2.3”制成样品溶液，并且在色谱条件下对每个20mu;L用于测量峰面积“2.5.1”。计算平均回收率和RSD，结果列于表2.5中，RA的回收率是可接受的（表2.5）

表2.5 Raddeanin峰值区域及其相对标准偏差的恢复测试