HAMI 3379，一种半胱氨酰白三烯受体2的拮抗剂，剂量和时间依懒性地减轻大鼠在局灶性脑缺血后脑损伤和抑制小胶质细胞炎症。外文翻译资料

HAMI 3379，一种半胱氨酰白三烯受体2的拮抗剂，剂量和时间依懒性地减轻大鼠在局灶性脑缺血后脑损伤和抑制小胶质细胞炎症。

Q. J. SHI， ^a，b H. WANG，^c Z. X. LIU， ^a S. H. FANG， ^a X. M.SONG， ^b Y. B. LU， ^a W. P. ZHANG， ^a X. Y. SA， ^b

H. Z. YING ^b 和 E. Q. WEI ^a*

摘要：半胱氨酰白三烯（CysILs）诱发炎症反应通过激活它们的受体，半胱氨酰白三烯受体1和半胱氨酰白三烯受体2。我们已经报道半胱氨酰白三烯受体2参与神经元损伤，星形细胞增生和神经胶质炎症，并且通过在大鼠大脑室内注射可选择性的半胱氨酰白三烯受体2的拮抗剂HAMI保护局灶性脑缺血后的急性脑损伤。在目前的研究中，我们明确大鼠大脑室内注射HAMI3379的保护作用的特点。我们发现HAMI3379（0.1–0.4 mg/kg）有效减轻大鼠大脑中动脉阻断（MCAO）24小时的急性脑损伤，治疗时间窗为1小时。它在大鼠MCAO后24和72小时减弱神经功能缺陷，减少脑梗死体积，减轻脑水肿，减轻神经元损失和退化。RNA干扰即脑内注射半胱氨酰白三烯受体2的短发夹RNA也能减轻急性脑损伤。同时，在大鼠MCAO后24小时HAMI3379抑制细胞因子IL-1beta;、干扰素-gamma;（IFN-gamma;）、肿瘤坏死因子-alpha;（TNF-alpha;）释放到血清和脑脊液中。此外，在大鼠MCAO后24小时，HAMI3379改善小胶质激活和中性粒细胞在缺血区域的聚集，但并不影响星形胶质细胞增殖。相比之下，半胱氨酰白三烯受体1拮抗剂普鲁斯特不影响小胶质激活和IFN-gamma;释放，但抑制星形胶质细胞增殖，减少血清中IL-4。因此，我们得出这样的结论，HAMI3379对急性及亚急性缺血性脑损伤具有保护作用，并能减轻神经胶质细胞相关的炎症反应。单独的半胱氨酰白三烯受体2拮抗剂或结合半胱氨酰白三烯受体1拮抗剂可能是一类新的治疗缺血性发作的治疗药物。2015 IBRO。由爱思唯尔有限公司出版并保留所有权利。

关键词：HAMI3379；半胱氨酰白三烯受体2；拮抗剂；小胶质细胞；炎症

引言

半胱氨酰白三烯（CysLTs），叫做白三烯C₄，白三烯D₄和白三烯E₄，是来自5-脂氧酶的花生四烯酸代谢通路的炎症介质（Singh et al., 2010; Back et al., 2011）。它们参与许多炎性疾病包括各种中枢神经疾病，如脑缺血（Fang et al., 2006; Fang et al., 2007;Zhao et al., 2011a）、脑出血（Ji et al.,2012）、脑外伤（Zhang et al., 2004; Hu et al.,2005），癫痫（Takahashi et al.,2013），和大脑肿瘤（Nozaki et al., 2010）。半胱氨酰白三烯至少作用于2个G蛋白偶联受体，半胱氨酰白三烯受体1 和半胱氨酰白三烯受体2（Singh et al., 2010; Back et al.,2011）。此外，存在额外的半胱氨酰白三烯受体的亚型被报道，比如GPR17，它被核苷酸和半胱氨酰白三烯激活（Ciana et al., 2006; Zhao et al., 2012），还有GPR99，它是优先被白三烯E4激活（Maekawa et al.,2008; Kanaoka et al., 2013）。

半胱氨酰白三烯受体1的特点已逐渐被阐明通过使用“经典”的拮抗剂如孟鲁司特，普鲁司特和扎鲁司特（Singhet al., 2010; Back et al., 2011）。在中枢神经系统中，半胱氨酰白三烯受体1与缺血损伤和缺血后修复有紧密联系。半胱氨酰白三烯受体1的拮抗剂普鲁司特和孟鲁司特对大鼠和小鼠局灶性脑缺血具有神经保护作用（Yu et al.,2005a，b; Chu et al., 2006; Fang et al., 2006; Zhaoet al.,2011b）。然而，半胱氨酰白三烯受体2病理生理作用了解不多，这是因为它缺乏可选择性的拮抗剂。在小鼠中半胱氨酰白三烯受体2基因敲除或者转基因方法证明了这种受体参与了炎症反应和肺纤维化（Beller et al., 2004），血管通透性（Hui et al.,2004; Jiang et al., 2008; Moos et al., 2008; Ni et al., 2014）和心肌缺血/再灌注损伤（Jiang et al., 2008）。有报道表明半胱氨酰白三烯受体2表达诱导脑外伤和肿瘤（Hu et al.,2005），并且它介导PC12细胞缺血性损伤（Sheng et al.,2006）。在大鼠局灶性脑缺血，脑内半胱氨酰白三烯受体2表达增加，而且在急性的阶段（24小时）增加的受体位于脑缺血中心区受伤的神经元；然而，在后期阶段（14天），它主要分布在脑缺血中心区的增生的小胶质细胞和边界区增殖的星形胶质细胞（Fang et al., 2007;Zhao et al., 2011a）。在局灶性脑缺血后，半胱氨酰白三烯受体2的时空分布与半胱氨酰白三烯受体1相似（Fang et al., 2006）。这些发现表明， 半胱氨酰白三烯受体2参与了缺血性脑损伤。

目前，选择性半胱氨酰白三烯受体2拮抗剂（除了非选择性拮抗剂Bay U9773），Bay CysIL2 和HAMI3379，已经被报道（Wunder et al.,2010; Ni et al., 2011）。Bay CysIL2减轻小鼠心肌梗死和抑制白三烯D₄诱导的小鼠耳朵脉管系统伊文斯蓝渗漏（Ni et al., 2011）；它还防止星形胶质细胞在体外发生缺血性损伤（Huang et al., 2008）。HAMI3379，3- -（{[（1S,3S）-3-carboxycyclohexyl]amino} carbonyl）-4-（3-{4-[4-（cyclo-hexyloxy）butoxy] phenyl} propoxy） 苯甲酸，缺乏半胱氨酰白三烯受体激动，而且对半胱氨酰白三烯受体2的亲和力比半胱氨酰白三烯受体1高10000倍（Wunder et al., 2010）。它有效逆转了白三烯C4诱导的灌注压力增加和离体豚鼠心脏的收缩力减少（Wunder et al., 2010）。我们已经表明，，HAMI3379减弱在体外缺氧缺糖诱导的缺血性神经元损伤，并且这是通过抑制小胶质激活介导的，而选择性半胱氨酰白三烯受体1拮抗剂孟鲁斯特对缺氧缺糖的小胶质细胞激活有一个弱的作用，它可能通过受体非依赖和依赖的机制减轻缺血性神经元损伤（Zhang et al.,2013）。此外，大鼠大脑室内注射HAMI3379保护大鼠防止局灶性脑缺血后急性脑损伤（Shi et al., 2012）。这些发现表明，半胱氨酰白三烯受体2拮抗剂可能是一种新型的治疗急性缺血性中风的药物，但是更多HAMI3379作用的细节需要进一步的调查，尤其是剂量和时间依懒性和由小胶质细胞激活介导的对缺血后炎症的抑制作用。炎症是当前研究缺血性中风的一个关键主题。大脑炎症细胞因子上调，局部小胶质细胞的激活，星形胶质细胞和全身淋巴细胞，白细胞浸润到脑对缺血性损伤有巨大贡献（Lambertsen et al., 2012; Xing et al., 2012;Turner et al., 2013）。HAMI3379是否抑制炎症反应，比如小胶质细胞的激活，脑内中性粒细胞浸润和炎性细胞因子的产生，至今不知道。在目前的研究中，我们通过腹腔注射给药，确定的HAMI3379剂量和时间依懒性的作用，并且在大鼠局灶性脑缺血24小时和72小时后评估它对损伤和炎症反应的作用。半胱氨酰白三烯受体1的拮抗剂普鲁斯特，因其先前的研究中已经证明对缺血性脑损伤急性和后期阶段的神经保护作用，在本实验中被作一种阳性对照药物。

实验步骤

动物

雄性SD大鼠（250 - 300g），购买于实验动物中心，浙江医学科学研究院，杭州，中国。[Certificate No. SCXK （Zhe） 2008-0033]。在实验前让动物适应饲养室，饲养条件为（20~24℃），7天的12h光暗交替。它们允许自由的摄入水和食物，除了术前禁食。所有的实验是根据国立健康指南护理和使用实验动物，并且得到浙江大学医学院动物保护委员会批准。我们做了一切努力来减少实验使用动物的数量和它们的痛苦。

化学药品

HAMI3379是来自Cayman化工有限公司（美国密歇根州安阿伯市）和普鲁斯特是由Masami Tsuboshima博士（Ono Pharmaceutical有限公司，大阪，日本）赠送。2，3，5—三苯基氯化四氮唑（TTC），甲苯基紫和水合氯醛，是从Sigma-Aldrich有限公司购买。（圣路易斯，密苏里州，美国）; Fluoro-Jade B 是来自Chemicon有限公司（特曼库拉， 加利福尼亚州， 美国）。其他试剂均为分析级并在市场上可以买到。

HAMI3379是溶解在二甲亚砜（DMSO）中，普鲁斯特是溶解在乙醇中。使用之前用生理盐水稀释。为了评估剂量依赖作用，稀释HAMI3379（0.025，0.05，0.1，0.2和0.4mg/kg，在稀溶液中最后DMSO的百分比为0.0625%，0.125%，0.25%，0.5% 和1%），稀释普鲁斯特（0.1mg/kg，最后乙醇的百分比为 0.25%），并在大鼠MCAO前30分钟进行腹腔注射，在我们先前的研究中再灌注后24小时测定大脑损伤（Zhang and Wei, 2003; Fang et al.,2006）。为了评估时间依赖作用，大鼠在MCAO后0、1、2和4 小时腹腔注射HAMI3379（0.1mg/kg），MCAO后24小时处死实验动物。为了评估MCAO后72小时的作用，在第一天大鼠MCAO后0和2小时腹腔注射HAMI3379（0.1mg/kg）和普鲁斯特（0.1mg/kg），然后每天一次直到72小时。在对照组大鼠中，同样体积的生理盐水（每100克体重0.2毫升）在同一时间点腹腔注射。

脑室内注射半胱氨酰白三烯受体2短发夹RNA

大鼠的半胱氨酰白三烯受体2短发夹RNA是为大鼠半胱氨酰白三烯受体2的沉默特殊设计的（GenePharma有限公司，上海，中国）。碱基的序列是5rsquo;-GATCCC CCC GTC AAC ATG TAT ACT AGC ATT TTC AAG AGA AAT GCT AGT ATA CAT GTT GAC TTT TTG GA AC-3rsquo;；阴性对照（NC）短发夹RNA的碱基的序列是5rsquo;-GAT CCC CCC TTC TCC GAA CGT GTC ACG TTT CAA GAG ATT CTC CGA ACG TGT CAC GTT TTT TGG AAC-3rsquo;。使用限制性内切酶Hpa I和Xho I将双链短发夹RNA寡核苷酸基因克隆至pFU-GW-RNAi慢病毒载体（GenePharma有限公司）中。

脑室内注射半胱氨酰白三烯受体2短发夹RNA给药。一个不锈钢的微量注射器立体定向插入左侧脑室前囟后0.6 mm，中线一侧1.3mm，从头骨表面向下垂直5mm的位置处（Pei et al.， 2010）。半胱氨酰白三烯受体2短发夹RNA （2X10⁶ TU in 4mu;L saline） 或无菌生理盐水（4mu;L）在大鼠MCAO或者假手术前72小时和48小时进行10分钟以上的注射。微量注射器维持10分钟以减少回流，然后撤除。在大鼠MCAO后24小时进行急性脑损伤评估。

为了确定半胱氨酰白三烯受体2信使RNA在大脑中的表达，在大鼠MCAO后24小时根据制造商的协议使用Trizol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）把同侧大脑皮层组织的全部RNA分离出来。使用PrimeScript^TMRT试剂盒（Takara，Otsu，Japan）进行2mu;gRNA的逆转录。使用SYBR Premix Ex Taq^TM（Takara）并采用定量PCR方法在LightCycler 480系统（Roche Diagnostics,Basel,Switzerland）中检测半胱氨酰白三烯受体2信使RNA的表达。引物碱基的序列如下：半胱氨酰白三烯受体2，forward 5rsquo;-TGT CAC CAG TGT CAG GAG TG-3rsquo;和reverse 5rsquo;-ACT TTT GAG GAC TCA GCT CCA A-3rsquo;；beta;-actin，forward 5rsquo;-GGC TGT ATT CCC CTC CAT CG-3rsquo;和reverse5rsquo;-CCA GTT GGT AAC AAT GCC ATG T

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