半胱氨酰白三烯受体-1部分介导小鼠脑冷冻伤外文翻译资料

半胱氨酰白三烯受体-1部分介导小鼠脑冷冻伤

摘要：目的：确定半胱氨酰白三烯受体（CysLT1受体）在大脑冷冻伤中的调节作用以及CysLT1受体拮抗剂pranlukast对冷冻伤的小鼠大脑的时间依赖性的保护作用。方法：在颅骨表面应用液氮和金属探针诱导大脑冷冻伤并观察损伤24小时后大脑病变、神经元密度和内源性免疫球蛋白分泌情况。CysLT1受体的转录和表达通过RT-PCR、免疫印迹和局部受体蛋白双重免疫荧光法。结果：大脑冷冻伤后6-24小时，CyslT1受体的mRNA和蛋白质表达上调。CysLT1受体主要是局部的神经元，而不是在小胶质细胞或星形胶质细胞。损伤前给予多剂量和单一剂量的pranlukast（0.1mg/kg）能够减轻冷冻伤。损伤后30Min（不是1h）给予单剂量的pranlukast也有效。结论：CyslT1受体对冷冻伤的小鼠至少有部分调节作用，其拮抗剂pranlukast对损伤治疗时间窗是30min。

关键词：半胱氨酰白三烯受体拮抗剂，pranlukast，冷冻伤，神经保护

1.引言

半胱酰胺白三烯（CysLT包括白三烯C4[LTC4],LTD4 LTE4），5-脂氧酶花生四烯酸的代谢产物酸是参与脑缺血和脑外伤的重要炎症介质。CysLT的活动是由G蛋白偶联受体介导的，即CysLT1和CysLT2受体。最近我们研究在局部缺血前或缺血后治疗中使用CysLT1受体拮抗剂pranlukast, montelukast可以减轻大鼠和小鼠的脑缺血状况。Pranlukast对N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）诱导的大脑损伤也产生一种保护作用。此外，我们发现大脑局灶性缺血的大鼠和小鼠以及NMDA损伤的小鼠的CysLT1受体表达增加。CysLT1受体的表达会诱导人类大脑的神经元、神经胶质细胞表现为创伤性损伤。这些发现表明，CysLT1受体会介导大脑损伤。然而，引起创伤性脑损伤的CysLT1受体的确切变化与表达仍然未知。

为了阐明CysLT1受体在创伤性脑损伤（TBI）中的作用，我们最近研究了pranlukast在大脑冷冻伤中的作用。大脑冷冻伤是一种切实有效的模型，该模型可模拟一些创伤性脑损伤的特点和相关的修复反应，例如血管源性脑水肿、炎症和血脑屏障（BBB）损伤。我们发现对老鼠冷冻伤前使用pranlukast治疗，可以产生一个与剂量成正相关的保护作用，这表明CysLT1受体可能调节创伤性脑损伤。然而，pranlukast在大脑冷冻伤后如何产生保护作用仍然是未知的。因为大多数创伤性脑损伤的病理生理变化类似于脑缺血，我们假设CysLT1受体在创伤性脑损伤后会产生类似于脑缺血的改变，创伤性脑损伤后使用pranlukast治疗可能产生保护作用。

2.材料和方法

2.1材料 pranlukast是由Masami TSUBOSHIMA博士赠与（日本大阪小野制药有限公司）。二甲胺四环素购自Syowa Hakko（日本东京）。水合氯醛，生物素化的IgG抗体以及2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）购自Sigma（美国密苏里州圣路易斯）。RT-PCR相关试剂是由TaKaR（日本京都）生产。多克隆兔抗人CysLT1抗体购自Cayman Chemicals（美国密歇根州安阿伯市）。小鼠单克隆抗体神经核(NeuN)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和CD11b,GAPDH,异硫氰酸荧光素(FITC)-山羊抗兔IgG多聚体，Cy3-山羊抗鼠IgG多聚体购自Chemicon International（美国加州特曼库拉）。生物素化的山羊抗兔IgG, 辣根过氧化物酶链霉亲和素和3,3′-二氨基联苯胺（DAB）购自中山生物技术（中国北京）。

动物 这项研究使用体重25-30g的雄性昆明小鼠（中国上海实验动物中心，证书编号22-001004）。所有实验的进行符合国家健康研究所关于实验动物的保养和使用指导。小鼠安置在恒温室中（22plusmn;1℃），12h光/暗周期，允许自由进食和饮水。

2.2冷冻伤和药物治疗 小鼠腹腔注射水合氯醛（400mg/Kg）麻醉，放置于立体定位架（日本东京Narishige，SR-5）。大脑冷冻伤的诱导是根据已报道的方法进行修改。简而言之，中线处切开头皮暴露颅骨，在完整的头骨右顶叶表面（1.5mm侧中线，前囟3mm）应用经液氮冷却的金属探针（重量100mg，直径3mm）作用30s。 手术期间测量直肠温度，使用加热垫和加热灯使体温维持在37plusmn;0.5℃。冷冻伤后缝合切口，将小鼠置于加热灯盒中复苏。，保持体温然后放回笼中。

在冷冻伤前，使用多组小鼠进行预处理，腹腔注射pranlukast（0.01和0.1mg/Kg）和二甲胺四环素(45mg/Kg)每天一次，连续3天。在冷冻伤前30min最后一次给药（共4次给药）。单剂量组的小鼠在冷冻伤前30min进行预处理或是损伤后1h给相同剂量的药物。同时。对照组腹腔注射生理盐水（5mL/Kg）。

2.3确定病灶体积和脑水肿 冷冻伤24h后将小鼠用水合氯醛麻醉，切下头部。快速取出大脑并切成1mm厚的冠状切片。切片在37℃用0.5%的TTC染色30min，然后用10% 缓冲福尔马林固定。染色切片的末端朝上，用数码相机拍照（日本东京富士山，FunePix,S602变焦）并记录在电脑上。每一片损伤和脑区是由图像分析软件（中国杭州，浙江大学，AnalyPower1.0）进行分析。病灶体积计算如下：病变体积=病变面积times;厚度（1mm），所有切片病灶体积的总和就是病变体积。脑水肿是通过病变半球增加的比例来间接评估的。

2.4病理学检查 另一组中，小鼠用水合氯醛麻醉，然后生理盐水预洗后穿心灌注4%多聚甲醛。大脑被移出后加4%多聚甲醛过夜，然后转移至30%蔗糖溶液中浸没3-7d。利用冷冻切片术（德国韦茨拉，莱卡，CM1900）沿大脑冠状面切成10mu;m厚的切片。将切片用抗NeuN（特定的神经元标记）单克隆抗体(鼠源)来检测神经元密度后制图。由于神经元损伤的核心几乎完全消失，我们可以观察到病变神经元的外围。大脑皮层第三和第四层（前囟末端1.8-2.0mm）。内源性IgG免疫染色用于检测血脑屏障的破裂。大脑切片相继与生物素化的鼠源IgG抗体（1:500），辣根过氧化物酶链霉亲和素（1:200）以及DAB反应。应用图像分析仪（美国圣安东尼奥，德克萨斯大学健康科学中心，Imagetool 2.0）对免疫组化切片进行光化学亮度检测。IgG的分泌用于评估受损半球亮度增加的比例，IgG%=(G_i-G₀)/ G₀times;l00%。这里，G_i=受损半球的亮度，G₀=对照组半球的亮度。

RT-PCR 在固定时间点，小鼠受损半球的大脑皮层和对侧皮层在冰上解剖，并在使用前储存于-70℃中。根据生产协议，使用Trizol试剂提取组织样本的总RNA。cDNA的合成即全部RNA（2mu;g）与0.2mu;g随机六聚体，20 U RNA酶抑制剂，1mmol/L dNTP以及200 U 反转录酶混合在20mu;L逆反应缓冲区进行。混合物在42℃环境中培养60min，然后在72℃中持续10min将逆转录酶灭活。

PCR使用Eppendorf Master Cycler（德国汉堡，艾普多夫）进行。混合物如下：1mu;L RT-cDNA样品溶解在包括20mu;L 1times;PCR缓冲液，200mu;mol/L dNTP，15mmol/L MgCl₂，每种引物20pmol以及0.5 U DNA聚合酶的反应混合物中。 循环参数如下：94℃维持2min，紧接着94℃维持30s，循环33次。然后63℃维持30s，72℃保持30s。最后一步是72℃扩展10min。小鼠样CysLT1受体本序列是如下cDNA序列的衍生物：5-CAA CGA ACT ATC CAC CTT CACC-3作为正义表达序列，5-AGC CTT CTC CTA AAG TTT CCAC-3为反义表达序列（产物规格164 bp）。内参样本的序列是以5-GTC GTA CCA CAG GCA TTG TGA TGG-3为正义表达序列，5-GCA ATG CCT GGG TAC ATG GTG-3 为反义表达序列（产物规格490 bp）。在含有溴化乙锭的2%的琼脂糖凝胶中使用电泳技术对扩增产物进行分离，并拍照。谱带的光密度由图像分析系统进行处理（美国加州，里士满，康达德）。CysLT1受体mRNA的含量是由CysLT1/内参的比例计算。

2.5蛋白印记法分析 在指定时间内，小鼠大脑受损半球的皮层在冰上迅速解剖，然后储存在-70℃中直到下次使用。脑组织样品匀浆; 然后将匀浆在15000times;g，4℃下离心30分钟，收集上清液。经过12％SDS-PAGE分离蛋白质样品（80mu;g）并转移到硝酸纤维素膜。用5％牛血清白蛋白封闭，然后与抗人CysLT1受体的兔多克隆抗体（1:2000）或抗GAPDH的小鼠单克隆抗体（1:5000）在4℃下孵育过夜。反复清洗后，膜与过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG（1:2000）一起孵育。 最后，蛋白条带通过增强化学发光可视化。通过激光密度计对蛋白条带进行扫描，并通过Meta Imaging Series 5.0（Bio-Rad，美国）进行分析。CysLT1受体蛋白质的量以CysLT1/GAPDH的比例计算。已经证实针对人CysLT1受体的抗体对小鼠脑组织是具有特异性的。

2.6 CysLT1受体免疫组织化学特异性分析 为了显示CysLT1受体在不同细胞类型中的定位，在10mu;m厚的切片上使用双重免疫荧光。简而言之，在室温下用5％正常山羊血清非特异性结合2小时以封闭IgG。每个切片在4℃用针对CysLT1受体的兔多克隆抗体和针对NeuN，GFAP（星形胶质细胞的特异性标记）或CD11b（小胶质细胞的特异性标记）的小鼠单克隆抗体的混合物孵育过夜。然后将切片与FITC结合的羊抗兔IgG和Cy3-结合的羊抗鼠IgG的混合物孵育，并在荧光显微镜（Olympus BX51，东京，日本）下观察。

2.7统计分析 所有值表示为平均值plusmn;SD。使用可用于Windows的SPSS 10.0软件包（SPSS，Chicago，IL，USA）进行单因素方差分析（Student-Newman-Keuls）用于统计分析。 P lt;0.05被认为具有统计学意义。

3.结果

3.1大脑损伤 在冷冻伤前使用多剂量的pranlukast（0.1mg / kg）和minocycline（45mg / kg）预处理3天，在冷冻伤后24小时显著减少损伤体积和脑水肿。在2种药物的单剂量组，预治疗前30分钟低温伤或低温伤后30分钟处理具有保护作用好。 然而，在低温伤后1小时用pranlukast进行的后处理没有显示出任何显着的保护作用，但minocycline仍然有效。Pranlukast 0.01mg / kg在任何给药方案（图1）都是无效的。 然后我们在以下实验中在低温伤后30分钟施用单剂量的这些试剂。

在冷冻伤后24小时，NeuN阳性神经元的密度在损伤的周围显着降低。 pranlukast（0.1mg / kg）和minocycline（45mg / kg）显著减弱神经元损失（P lt;0.01，图2）。 在损伤的皮层中发现内源性IgG渗出，表明BBB坏裂。 pranlukast（0.1mg / kg）和minocycline（45mg / kg）显着降低IgG渗出（P lt;0.01，图3）。

3.2 CysLT1受体的表达 冷冻伤后6,12和24小时，CysLT1受体在受损皮质中的表达显著增加，然后在损伤后48小时恢复（图4B）。 在低温伤后48小时，对侧皮层中的表达没有改变（图4A）。

冷冻伤后6,12和24小时，CysLT1受体蛋白在损伤皮质中的表达也显着增加（图4C）。 minocycline（45mg / kg），显著抑制增加的表达，而非pranlukast（0.01和0.1mg / kg）（P lt;0.05，图5）。 双重免疫荧光显示CysLT1受体免疫反应增强，但它们表达的CysLT1受图1. minocycline 和pranlukast对病灶体积和脑水肿的时间依赖性的效应，24h后的损伤。（A）在小鼠多剂量预处理后，TTC染色脑切片显示皮质病变（箭头）。（B ）和（C）病灶体积在损伤

图2.冷冻伤24h的小鼠单剂量给pranlukast或minocycline后对神经元密度的影响（30min）.（A）显微照片显示经过冷冻伤周边区的NeuN阳性神经元的损伤。（B）神经元密度报告平均plusmn;SD；N =5只为假手术组，其他各手术组各为n=8只.CP＜0.01对应假手术组，FP＜0.01对应冷冻伤组，单因素方差分析，比例尺= 25mu;m.

图3. .冷冻伤24h的小鼠单剂量给pranlukast或minocycline后对内源性IgG渗出的影响（30min）（A）照片显示IgG阳性。（B）IgG渗出率报告平均为MEAplusmn;SD；n = 5只为假手术组，n=8只小鼠为其他各手术组。FP＜0.01对应冷冻伤组，单因素方差分析，ND，不能检测.

图4.小鼠脑损伤后的CysLT1受体表达的时间过程。（A）RT-PCR分析表明，转录对侧皮质是不变的，（B）损伤皮层中CysLT1受体的表达在冷冻伤后6，12，24h增加.

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