CysLT₂受体介导脂多糖诱导的体外小胶质细胞炎症引起的神经毒性

Lu Chen, Yi Yang,Chen-Tan Li Si-Ran Zhang,Wei Zheng,

Er-Qing Wei,Li-Hui Zhang

摘要：小胶质细胞激活引起的神经炎症在包括帕金森氏病（PD）在内的多种神经退行性疾病中起着关键作用。最近的研究表明，半胱氨酰白三烯受体2（CysLT2R）参与脑缺血后的炎症和脑损伤。然而，CysLT2R在与PD相关的小胶质细胞反应中的作用仍不清楚。在本研究中，我们确定了CysLT2R在小胶质细胞炎症中的调节作用，以及其在小胶质细胞活化剂脂多糖（LPS）诱导的体外脑部炎症模型中的神经毒性。我们发现LPS诱导了鼠小胶质细胞系（BV-2细胞）的吞噬作用并增加了促炎细胞因子的产生，包括肿瘤坏死因子-alpha;（TNF-alpha;），白介素-6（IL-6）和白介素-1beta;（IL-1beta;）。在LPS激活的BV-2细胞中，CysLT2R蛋白的表达上调，并诱导CysLT2R发生核移位。CysLT2R选择性拮抗剂HAMI 3379显著抑制LPS诱导BV-2细胞的吞噬作用和细胞因子的过度生成。同样，CysLT2R的基因沉默剂-特定短发夹RNA（shRNA）对BV-2细胞的作用与HAMI 3379相同，表明该作用可能是CysLT2R依赖性的。此外，源自LPS处理的BV-2细胞的条件培养液（CM）诱导了大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系（PC12）的细胞死亡。HAMI 3379和CysLT2R shRNA通过抑制LPS激活的小胶质细胞释放的神经毒性细胞因子的产生，减轻了神经元的死亡。总的来说，这些结果表明，CysLT2R介导LPS诱导的小胶质细胞炎症和继发的神经毒性。CysLT2R是可能的分子靶点，调节神经退行性疾病（例如PD）中的小胶质细胞介导的神经炎症。

关键词： 小胶质细胞；炎症；神经毒性；半胱氨酸白三烯受体2；拮抗剂；RNA干扰

1. 引言

小胶质细胞是大脑的重要免疫细胞。在多种病理反应如感染，中风或神经退行性过程，小胶质细胞迅速激活。在一系列神经退行性疾病，包括帕金森氏病（PD），活化的小胶质细胞增加促炎细胞因子的产生，引起小胶质细胞相关的神经毒性。（ Glass等人，2010年；More等人，2013年；Nolan等人，2013年，Ramsey和Tansey，2014年）。在PD实验中，抑制或阻断小胶质细胞活化，可减轻黑质纹状体炎症，减少多巴胺能神经元的死亡（Glass et al。，2010 ; Ramsey and Tansey，2014 ; Tansey and Goldberg，2010）。因此，发现调节小胶质细胞活化和促炎性介质释放的分子，可为PD的治疗提供新的治疗策略。

半胱氨酰白三烯（CysLTs）是与脑缺血性损伤密切相关的重要的炎症介质。CysLTs至少通过两种不同的CysLT 受体（CysLT1R和CysLT2R）诱导炎症反应（ Bauml;ck等，2011； Singh等，2010）。据报道，CysLT1R在脑缺血损伤中起重要的调节作用， CysLT1R选择性拮抗剂普鲁司特和孟鲁司特对脑缺血具有保护作用（ Fang等，2006； Yu等，2005； Yu等。等，2014年，Zhang和Wei，2003，Zhang等，2013，Zhao等，2011b）。与 CysLT1R 相比，CysLT2R的作用仍不清楚，因缺乏选择性的CysLT2R拮抗剂（除了非选择性 CysLT1R / CysLT2R拮抗剂Bay U9773）。最近，HAMI 3379被报道为CysLT2R的选择性拮抗剂（Wunder等人，2010年）。最近的一些研究发现CysLT2R参与大鼠局灶性脑缺血的缺血后炎症和脑损伤，以及体外糖氧剥夺诱导的局部缺血样损伤，并且HAMI 3379 通过拮抗CysLT2R可保护神经元免受缺血性脑的损害（Shi等，2012 ; Shi等，2015 ; Zhao等，2011a ; Zhang等，2013）。但是，CysLT2Rs是否介导PD中小胶质细胞炎症和小胶质细胞依赖的神经毒性尚不清楚。

在本研究中，我们在体外脂多糖（LPS）诱导的PD炎症模型中确定了CysLT2R在小胶质细胞炎症和随后的神经毒性中的调控作用（Chinta 等，2013 ; Hosoi等，2014 ; Svensson等等人，2010年）。此外，我们还研究了CysLT2R选择性拮抗剂和RNA干扰对LPS引起的PD相关神经炎症的神经保护作用。

2．结果

2.1. LPS诱导BV-2细胞中CysLT2R表达

应用蛋白质印迹和免疫双标实验以检测CysLT2R蛋白的表达。CysLT2R在正常鼠小胶质细胞系（BV-2细胞）中微弱表达。然而，暴露于0.1、1、10和100 ng / ml LPS 24小时或0、6、12 和24 h 100ng / ml LPS会引起BV-2细胞中CysLT2R蛋白表达的浓度和时间依赖性增加。（图1 A和B）。暴露于100ng / ml LPS后24小时，观察到CysLT2R水平显着增加（1.88倍）（ P lt;0.01 vs control组）。免疫细胞化学分析表明，LPS 以时间依赖性方式诱导CysLT2R从细胞质转运到细胞核的移位（图1 C）。这些发现表明，LPS上调了BV-2细胞中CysLT2R的表达。

图1. LPS诱导BV-2细胞CysLT₂R表达和核定位。（A）将细胞暴露于10和100 ng / ml LPS 24 小时后，CysLT₂R表达增加。（B）将细胞暴露于100 ng / ml LPS 24 小时后，CysLT₂R表达增加。n = 9（A）或7（B）; * P lt;0.05和**P lt;0.01与对照组相比。（C）在对照组BV-2细胞，CysLT₂R主要分布在胞质中，但是暴露于100 ng/ml LPS 12-24 小时后发现核CysLT₂R含量增加 。

2.2 . LPS增强BV-2细胞的吞噬作用和促炎细胞因子释放

为了解LPS对小胶质细胞活化的影响，我们进行了BV-2细胞的吞噬活性和促炎细胞因子的释放实验。我们发现10ng/ml 和100 ng/ml LPS对BV-2细胞无毒，并且通过3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化四唑（MTT）测定法确定细胞活性轻度增加（110.7plusmn;3.5％和111.3plusmn;2.1％vs 100.0plusmn;2.3％； P lt; 0.05或P lt; 0.01 vs对照组）。流式细胞仪检测结果显示，处理24 小时后，LPS（10和100 ng / ml）促进了小胶质细胞的吞噬活性（ 图2A和B），表明LPS诱导BV-2细胞活化。此外，酶联免疫吸附试验（ELISA）显示在激活的BV-2细胞中10和100 ng/ml的LPS明显增加促炎细胞因子白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1beta;（IL-1beta;）的释放以及100 ng / ml LPS增加肿瘤坏死因子-alpha;（TNF-alpha;）（图2 C-E）。LPS诱导的小胶质细胞活化和随后释放的细胞因子的最佳条件是100 ng/ml处理24小时。此条件用于以下实验。

图2. LPS增强BV-2细胞的吞噬作用和细胞因子释放。（A）BV-2细胞吞噬作用的流式细胞仪分析暴露于LPS 24小时。（B）流式细胞仪分析的定量数据。（C–E）暴露于LPS后24小时，BV-2细胞释放TNF-alpha;（C），IL-6（D）和IL-1beta;（E）. n=6; *P,0.05,**Plt;0.01,***P,0.001

2.3. CysLT2R拮抗剂对LPS诱导的小胶质细胞吞噬作用和BV-2细胞释放细胞因子的影响

为了阐明小胶质细胞CysLT2R的调控作用，我们评估了CysLT2R选择性拮抗剂HAMI 3379对LPS诱导的小胶质细胞活化和细胞因子释放的影响。0.001-1mu;M的HAMI 3379 不会影响BV-2细胞的活性（数据未显示）。但是，它有效抑制LPS（100 ng/ml）诱导的小胶质细胞吞噬作用（图3 A和B），并剂量依赖性地降低LPS诱导的活化BV-2细胞释放TNF-alpha;，IL-6和IL-1beta;等促炎细胞因子。（图3 C-E）。我们的发现，HAMI 3379可以显著抑制LPS诱导的小胶质细胞活化和细胞因子产生。

图3. CysLT₂R拮抗剂HAMI 3379对LPS诱导的BV-2细胞吞噬作用和细胞因子释放的影响。 （A）流式细胞术分析显示LAMI诱导的吞噬作用被HAMI 3379减弱。（B）流式细胞术分析的定量数据。（C–E）HAMI 3379逆转了LPS诱导的TNF-alpha;（C），IL-6（D）和IL-1beta;（E）的过量产生。

2.4 . CysLT2R沉默对LPS诱导的BV-2细胞小胶质细胞吞噬作用和细胞因子释放的影响

通过将CysLT2R慢病毒短发夹（sh）RNA 转染到BV-2细胞中，RNA沉默进一步证实了CysLT2R的参与。进行RT-PCR和Western blot检测CysLT2R的mRNA和蛋白表达。CysLT2R慢病毒shRNA（感染复数= 10）的转染可降低 BV-2细胞中的CysLT2R mRNA（〜50％）和蛋白质水平（〜41％）（图4A和B）。免疫细胞化学分析证实了shRNA沉默CysLT2R的有效性（数据未显示）。

图4. 测定BV-2细胞中CysLT 2 R沉默的功效。 用CysLT₂R shRNA（MOI=10）处理BV-2细胞后，分别通过RT-PCR和Western blot分析CysLT2R的mRNA和蛋白表达。 CysLT2R shRNA抑制BV-2细胞中CysLT₂R的mRNA（A）和蛋白（B）表达.

此外，流式细胞仪结果表明，LPS增强了BV-2细胞的吞噬活性，而CysLT2R shRNA则抑制了BV-2细胞的吞噬活性（图5A和B）。ELISA分析还表明，LPS明显增加了细胞因子的生成，但CysLT2R shRNA 可逆转这种增加（图5C-E）。这些结果表明，CysLT2R可能是LPS诱导的小胶质细胞吞噬作用和细胞因子释放的决定因素。

图5. CysLT₂R沉默对LPS诱导的BV-2细胞吞噬作用和细胞因子释放的影响。（A）流式细胞仪分析表明，CysLT₂RshRNA减弱了LPS诱导的吞噬作用。 （B）流式细胞仪分析的定量数据。（C–E）CysLT₂RshRNA抑制LPS诱导的TNF-alpha;（C），IL-6（D）和IL-1beta;（E）释放。

2.5.小胶质细胞介导的PC12细胞神经毒性和CysLT2R拮抗剂的作用

众所周知，小胶质细胞的活化导致神经毒性细胞因子的释放，进而可能参与神经退化的发生。为了了解CysLT2R在BV-2细胞介导的神经毒性中的作用，将大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞培养于LPS（100 ng / ml）刺激的B​​V-2细胞收集的BV-2条件培养液（CM）培养。LPS处理的BV-2 CM在暴露后24小时不影响PC12细胞的存活。然而，将PC12细胞暴露LPS处理的BV-2 CM 48小时后，PC12细胞的活性呈剂量依赖性降低（图6）因此，在以下实验中， PC12细胞用LPS（100 ng / ml）处理的BV-2 CM培养48小时。

图6. 暴露于LPS处理的BV-2CM后，PC12细胞的活力。MTT法检测表明，LPS处理的BV-2 CM以时间和剂量依赖性的方式诱导了PC12细胞的活力丧失，并被CysLT2R shRNA抑制。

由于CysLT2R拮抗剂HAMI 3379抑制LPS诱导的小胶质细胞吞噬作用和BV-2细胞内细胞因子的释放，因此我们探讨了HAMI 3379对活化的BV-2细胞诱导的神经毒性的潜在神经保护作用。 在存在或不存在HAMI 3379（ 0.1mu;M）的情况下，用LPS（100ng / ml）处理BV-2细胞，然后收集CM以处理PC12细胞。LPS（100 ng / ml）本身不会诱导PC12细胞的损伤或死亡。但是，LPS处理的BV-2 CM显著诱导了PC12细胞的细胞形态变化并降低了细胞活力。与比对照培养液组相比，LPS处理的BV-2 CM中生长的PC12细胞神经突起减少、变短。通过用 0.1mu;M HAMI 3379 预处理BV-2细胞来逆转这些变化（图7A和B）。另外，流式细胞测定结果表明，与对照组相比，PC12细胞暴露于LPS处理的BV-2 CM导致细胞死亡增加了6倍。用HAMI 3379（ 0.1mu;M）预处理BV-2细胞可减少由LPS处理的BV-2 CM诱导的PC12细胞死亡（图7 A和C）。这些结果表明，HAMI 3379通过阻断CysLT2R可能对激活的小胶质细胞介导的神经毒性具有神经保护作用。

图7 .暴露于LPS处理的BV-2 CM后，PC12细胞的形态，活力和死亡以及CysLT2R拮抗剂的作用。（A）形态学检查（上图）和流式细胞术分析（下图）显示，通过用CysLT2R拮抗剂HA

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