通过内部转录间隔区和简单的序列重复进行序列多样性分析以鉴定石斛种类外文翻译资料

通过内部转录间隔区和简单的序列重复进行序列多样性分析以鉴定石斛种类

摘要：兰科是最大和最多样化的开花植物科之一。石斛属作为观赏植物和其药用价值具有很高的经济潜力。另外，该属的物种能够产生大农作物。然而，许多石斛在外观上都非常相似，因此很难将一个品种与另一个品种区分开。这项研究表明，通过内部转录间隔区（ITS）序列分析，本研究中使用的12个石斛品种可分为两组。红色和黄色的花朵也可以用来将这些物种分为两个主要类别。特别地，落叶特性与A群的ITS遗传多样性有关。在53个设计的简单序列重复（SSR）引物对中，有7个对从特定条带扩增的聚合酶链反应产物具有多态性。这项研究的结果表明，这7对SSR引物对可能在未来的研究中用于鉴定石斛种类及其后代。

关键词：石斛；内部转录间隔区；分子标记；简单的序列重复。

简介

兰科是最大和最多样化的开花植物科之一。地球上有近700属和大约20, 000种兰花。大多数兰科植物稀有和濒临灭绝，并且具有很高的经济价值。例如，铁皮石斛属是作为观赏植物和药用目的具有很高经济潜力的兰科。另外，该属的物种能够产生大农作物。石斛市场上的石斛品种繁多而复杂。然而，由于它们在花的发育之前非常相似的外观，很难将一个品种与另一个品种区分开，从而使识别成为难题。为了避免石斛市场中供需方面的错误，使用生物分子标记作为识别方法非常重要。

分子标记，例如简单序列重复（SSR），ISSR，AFLP和RAPD，是鉴定品种，选择亲本进行杂交育种和保存遗传资源的有效工具。分子标记技术已经运用于识别桑属（Kalpana等人，2012）、杏李属(Pedryc等人., 2009) 、姜属(Vanijajiva 等人., 2005), 苦荞麦(Garima等人., 2012), 和番茄属 (Meng等人., 2010) 等农作物品种。分子标记用于选择亲本以进行杂交育种，保护遗传资源以及分析遗传多样性，此外还可以估计不同兰花品种的遗传多样性。特别是，内部转录间隔区（ITS）技术已经常用于使用生物分子标记物鉴定兰科。 但是，由于ITS技术的多样性，使用起来既费时又昂贵。 因此，为了降低成本并提高兰科的鉴定效率，需要更容易获得和可靠的分子标记方法来鉴定兰科。最近，与其他生物分子标记方法相比，已开发出SSR方法以提供更高的效率和更低的成本。 本研究利用12个石斛变种的原始ITS序列来探讨它们的系统发生关系，并利用SSR引物鉴定了这12个石斛。因此，我们开发了一种使用SSR生物分子标记物鉴定石斛品种的技术。 新加坡人（Yue等人，2006）和泰国人（Phuekvilai等人，2009）的研究人员也成功地使用了SSR标记作为识别兰科的工具。

材料与方法

植物原料

台湾国立萍通科技大学的Chin教授提供了十二种植物样品。 根据其红色和黄色花序，可以将这12个石斛样品分为两个主要组。 这些样品的特征性特性见图1和表1。

图1.研究的12个石斛品种的花序图片

表1. 12个品种的物种名称，地理分布，花序颜色和ITS分类

DNA提取

直接从植物材料上切下茎或叶，在液氮中冷冻，并在分析前于-80°C储存。使用Axygen植物DNA提取试剂盒从样品中提取基因组DNA后，将提取的基因组稀释至5 ng / micro;L，并保存在-20℃下。

初始设计

从文献中直接复制了53对SSR引物，包括从Vanda兰花开发的7对引物（Phuekvilai等，2009）和从Mokara兰花开发的2对引物（Phuekvilai等，2009）；从表皮兰花中开发了9对引物（Pinheiro等。，2009）；从石斛兰开发的8对引物（Boonsrangsom等，2008）；从石斛兰开发的14对引物（Yueet等，2006）；从兰花兰开发的13对引物（Huang等，2010）。

根据GenBank序列号为EU4775071的石斛属物种的DNA序列设计了一对ITS引物。 正向和反向引物与247个至270个核苷酸的DNA序列以及597个至620个核苷酸的DNA序列一致，设计为24个核苷酸范围。

PCR扩增

对于SSR，在20 micro;L最终体积中进行聚合酶链反应（PCR）扩增，该最终体积包含20 ng基因组，2micro;L二甲基亚砜（DMSO），2micro;L PCR缓冲液，400 micro;M dNTP，1micro;L每种引物（正向和反向引物），0.4micro;L Taq DNA聚合酶和9.2 micro;L水。将以下PCR程序设置为在94°C变性4分钟，然后在94°C进行35次循环40 s，在54°-59°C进行Ta 40s，72°C进行30 s，最后在72℃下延伸10分钟，然后在4℃下保持。

对于ITS，在50mu;L终体积中进行PCR扩增,该终体积包含40 ng基因组，5mu;L DMSO，5mu;L MgSO，5mu;L PFU缓冲液，1000mu;M dNTP，1mu;L每种引物（正向和反向引物），0.5 micro;L PFU DNA聚合酶和23.5 micro;L水。 将PCR程序设置为在94°C变性4分钟，然后在94°C进行35循环40 s，55°C进行40 s，72°C进行30 s，最后延伸至72°C 10分钟，然后保持在4℃。

ITS基因克隆

在凝胶上纯化的ITS PCR产物与DNA连接酶一起使用，以将ITS片段掺入带有内部限制酶（Sma I）的质粒（p-True Blue）中。 随后，使用热激法将载体转化为大肠杆菌（XL1-Blue），并对所得的ITS片段进行测序。

系统发育关系分析

确认植物材料的ITS序列3次，然后使用分子进化遗传分析（MEGA）软件版本4.0分析它们的系统发育关系并构建系统树。

结论

12个石斛样品的系统发生关系

通过ITS将研究的12个石斛样品分为2个主要组，分别称为A和B。A组包括D. nobile Lindl., D. hercoglossum Rchb.f., D. nobile var. cooksonianum Rchb.f., D. moniliforme (L.) Sw., D. unicum Seidenf., D. pendulum Roxb., and D. wardianum Warner，B组包括D. heterocarpum Wall. ex Lindl., D. findleyanum Parish amp; Rchb.f., D. signatum Rchb.f., D. linawianum Rchb.f., and D. friedericksianum Rchb.f.（如图2所示）。我们还发现，根据花序的颜色，这12个树种可分为2组。 红色（包含更多的花色素苷）和黄色（包含更多的类胡萝卜素）。红色组包括D. nobile Lindl., D. moniliforme (L.) Sw., D. findleyanum Parish amp; Rchb.f., D. pen- dulum Roxb., D. linawianum Rchb.f., D. hercoglossum Rchb.f., D. wardianum Warner, andD. var. cooksonianum Rchb.f.，黄色组包括D. heterocarpum Wall. ex Lindl., D. signatum Rchb.f., D. friedericksianum Rchb.f., and D. unicum Seidenf。

如表1所示，花色组和ITS组的比较非常相似，不同的是花序D. unicum Seidenf为橙色，以及D. findleyanum Parish amp; Rchb.f 和D. linawianum Rchb.f.，它们在各自的ITS序列中具有与主要颜色类型相反的颜色。 此外，我们还发现落叶落叶石品种也倾向于在A组中反映ITS序列。

图2使用MEGA 4.0根据ITS序列在12个石斛品种之间的遗传关系树状图。

SSR标记信息分析

在53对设计好的SSR引物中，有7对产生了用于本研究的12个铁皮石斛变种的非常特殊的条带。 具体来说，从表皮兰花中开发了9对引物中的1对，从石斛兰花中开发了22对引物中的2对，从中国兰花中开发了13对中的4对。所选引物及其序列如表2所示。

表2. 7对SSR引物的序列和参考

在对D. nobile Lindl的分析中。 使用B6-2引物，鉴定出的主要条带包含330-，240-和175-bp的条带。 由于无法通过其他品种的分析鉴定出240 bp的条带，因此我们认为它是特异性的。 因此，有可能使用这个特定的240 bp频段来区分D. nobile Lindl来自其他品种。

当使用引物B11-3进行果皮杜鹃壁的分析时。例如Lindl，鉴定出的主要谱带包含350和270 bp谱带.对于D. findleyanum Parish＆Rchb.f主要谱带为270、180和170 bp。对于D. unicum Seidenf，主要条带是400、210和180 bp。 对于石竹墙，例如Lindl，主要特异性条带为350 bp。对于D. findleyanum Parish＆Rchb.f，主要特异性条带为170 bp。对于D. unicum Seidenf，主要特异性条带为210 bp。 因此，该方法可用于鉴定本研究中使用的12个石斛品种。

在这7对引物中，B6-2引物可用于鉴定本研究使用的12种石斛属植物中的7种，B5-3可以鉴定5种，引物A5-3和B6-3 可用于识别4种，B11-3可用于识别3种，B9-3引物可用于识别2种，而A12-3引物可用于识别1种。 但是，在7个引物对中，不能使用单个引物对来鉴定D. pendulum Roxb。统计信息如表3所示。

表3.使用7对选择的SSR引物对12个品种PCR的多态条带模式进行分析

讨论

在这项研究中，我们发现根据其花序的颜色和落叶特性，可以将12个石斛栽培品种分为两个主要组，这些组与它们的ITS组几乎匹配。而且，我们发现了D. pendulum Roxb与D. wardianum Warner的花序非常相似，根据其基于ITS序列的亲缘关系，将其分为少数。 韩国研究人员的一份报告指出，研究中使用的兰花可以根据叶片形态分为三类，与它们的RAPD分组相匹配。韩国研究人员也发表了另一项研究，该研究表明，从兰花的RAPD分析得出的系统发育树与从传统分类得出的相似。因此，我们基于这两个相似研究的发现，相信基于ITS序列的遗传关系具有一定程度的可信度和准确性。微卫星标记可用于区分石斛品种。泰国研究人员表明，某些引物对的多态性谱带模式可用于鉴定兰科植物品种，并证明其遗传关系。新加坡研究人员报告说，SSR标记可用于石斛品种的鉴定。本研究中使用的12个铁皮石斛变种通常被用作一系列商品铁皮石斛变种的亲本。D. nobile Lindl. 和 D. moniliforme (L.) Sw代表了两个新石斛栽培品种非常重要的遗传来源。根据血统分析，D. nobile Lindl 和D. moniliforme (L.) Sw.分别构成500多个铁皮石斛品种的41.14和19.43％。在这项研究中，从7个选择的引物中有3个产生了对D. nobile Lindl.的特定条带模式，在7个选择的引物中有1个引物产生了对D. moniliforme (L.) Sw的特定带状。这4种引物可能是鉴定这2个非常重要的品种的有用工具。在这项研究中发现的微卫星标记揭示了石斛的相当大的遗传多样性，这有助于品种鉴定。

外文文献出处：Analysis of sequence diversity through internal transcribed spacers and simple sequence repeats to identify Dendrobium species

原文

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