植物愈伤组织培养的生物技术应用外文翻译资料

植物愈伤组织培养的生物技术应用

原文作者：Thomas Efferth

单位：约翰内斯·古登堡大学美因茨制药与生物化学研究所药物生物学系

摘要：在民族药物学，特别是在传统中药中，药用植物已有数千年使用历史。同样，农业植物的使用也贯穿于整个人类历史。近年来，植物基因工程技术能培育出具有理想性状特征的植物，这一技术的发展为人类对植物的利用提供了一个新的增长维度。在过去的几十年里，相关植物的生物技术已逐渐成熟，在这一背景下产生了大量生物工程应用实例。愈伤组织培养和悬浮细胞培养技术在药理学和药学（包括中药）以及农业和园艺学中应用广泛。本文提供了愈伤组织培养在这些科学领域的最新进展。通过基因技术得到的转基因愈伤组织培养物可用于合成具有生物活性的次生代谢产物，以及提高植物对盐、水分、病虫害的抗性。虽然植物愈伤组织培养技术的潜力尚未被完全发掘，但研发和销售更多基于愈伤组织培养产品的时机已经成熟。

关键词：抗体生产、胚胎发生、基因技术、器官发生、药理学、植物化学、植物再生、次生代谢产物、干细胞

1 引言

生物工程领域聚焦于利用生物学原理来生产经济实用的产品。医疗设备、诊断工具、生物相容性材料、可回收生物能源、农业工程等都需要生物工程技术的支持。生物工程旨在重建或完善生物系统，从而在生物技术、微生物、生物催化等领域生产适销产品。组织工程学不仅与人（或动物）组织替代有关，还与植物组织有关。此外，制药科学包括生产化学药物和重组蛋白（即治疗性抗体）的工程技术。这个新领域被称为制药工程。自古以来，人类一直以各种植物作为药物、农用化学品和营养品生产的来源。直至今日，世界上几乎所有人都依赖于植物衍生产品。近来，生物技术为植物离体培养系统（如愈伤组织培养、悬浮细胞培养和器官培养）的生产和基因操作提供了绝佳的机会，可以促进所需植物和植物产品的生产。现在越来越多的自然栖息地正遭到快速破坏，离体生物技术可能有助于减缓濒危物种的灭绝。

植物通过惊人的可塑性重塑自身^[1]，并通过自身产生的诱导子来激活防御反应^[2]，释放出次生代谢产物，从而适应非生物和生物胁迫。次生代谢产生的化合物可由外部应激信号（如病原菌诱导子、氧化应激、损伤等）诱导，这些信号由茉莉酮酸、水杨酸及其衍生物作为信号转导因子^[3]在体内介导。这些诱导子分子刺激植物的防御或应激反应，它们可能来自于病原体本身（外源性诱导子，如壳多糖、壳聚糖和葡聚糖）或由植物在病原体（内源性诱导子，如果胶、果胶酸、纤维素和其他多糖）的作用下释放^[4]。相比这些生物诱导子，还有非生物诱导子充当物理介质（即冷、热、紫外线和渗透压）和化学试剂（即乙烯、杀菌剂、抗生素、盐和重金属）。诱导子在化学和生理刺激^[5]下调节基因表达。它们还诱导酶的合成，从而促进众多次生代谢产物的形成，如类黄酮、生物碱、萜类、硫氨酸、苯丙类和多肽^[6]。

意外发现，许多次生代谢产物不仅具有保护功能，还对人体具有药用价值。因此，植物细胞培养为简单且可扩展的次生代谢产物的生产提供了令人瞩目的来源。科学家已研究了如何优化体外植物培养条件、提高次生代谢产物的产量的方法。此外，通过对小麦、水稻、玉米等经济作物进行基因操作已经培育出了抗逆境和抗病的品种^[7]。因此，植物生物技术可在工业规模上改善传统农业生产^[8]。

植物组织培养是基础科学和工业应用中的一项重要技术。在所有陆生植物主要的科中，损伤组织都通过未分化的愈伤组织细胞修复。这些愈伤组织细胞可以在体外培养用于生物技术应用。几乎植物的任何部分都可以用来培养愈伤组织细胞。如果在无菌条件下避免微生物感染，并在添加生长激素（即生长素、细胞分裂素）的固体凝胶介质上培养，从植物组织中提取的外植体会在体外慢慢从无色无定形生长成浅棕色的细胞团。通过有规律的细胞传代，愈伤组织培养物可以在体外无限期维持。分化的植物细胞和培养的愈伤组织细胞差异相当大。愈伤组织细胞类似于未分化的分生组织细胞，除此之外，它们只表现为小液泡并缺乏进行光合作用的叶绿体。如果处于适宜生长的非标准培养基中，愈伤组织培养物可以再分化成整株植物。一些愈伤组织培养物需要在黑暗的条件下生长，而有些需要在特定的昼夜条件下生长（例如，16 h光照，8 h黑暗）。愈伤组织培养物通常在25plusmn;2℃下生长。它们可以被区分为相对紧凑和相对脆性两种愈伤组织。脆性愈伤组织培养物可用于在慢摇液体培养基中生成单细胞培养物。

植物组织培养可以追溯到20世纪初，Gottlieb Haberlandt（1854—1945年）培养了第一个愈伤组织根或胚性培养物^[9]。在20世纪40~60年代，随着技术的进步，植物组织培养技术得以进一步发展，可以研究细胞行为（包括细胞学、营养、代谢、形态发生、胚胎发生、病理学）、脱病植株的产生、种质保存和无性繁殖的条件。自20世纪60年代以来，次生代谢产物的生物合成已成为人们关注的一项课题。随着基因技术方法的出现，愈伤组织培养和其他植物组织技术得到了新的应用^[10]。植物细胞培养是生物反应器大规模生产与治疗相关的次生代谢产物（如抗癌药物）的有效手段^[11]。与传统的全株培养相比，细胞培养系统的主要优点包括：①所选择的植物化合物可以独立于外部因素（如土壤组成或气候）产生；②培养的细胞不受微生物或昆虫攻击的威胁；③任何植物的细胞，甚至稀有或濒危植物，都可以很容易地维持，以产生其次生代谢产物；④机器人？驱动的次生代谢产物调节降低了成本，提高了生产率。

2 愈伤组织形成

众所周知，来自动物组织的干细胞通常最终分化为成熟的组织细胞。然而，人们认为植物组织中的分化组织细胞具有去分化和再生损伤组织，甚至形成整个植株的能力，也有人认为它们可以形成全能的愈伤组织细胞^[12–15]。最近，有一种观点认为植物细胞不会再分化，而愈伤组织是由已存在的干细胞形成的^[16,17]。导致干细胞分化和（或）植物体细胞分化-去分化的潜在分子作用模式尚未完全清楚。干细胞相关基因对去分化过程至关重要。它们的表达不仅受到转录因子的调节，还受到组蛋白修饰和DNA甲基化等表观遗传事件的调控^[18]。

拟南芥[Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.]可作为多种植物学研究的模式生物。在这些植物中，胚胎愈伤组织中植物激素生长素的梯度通过调节肽基脯氨酰顺反异构酶1（PINFORMED1，PIN1）蛋白从而诱导干细胞的形成^[19]。

通过活细胞显微成像研究了激素和发育分生组织调节因子的时空分布动力学。与生长相关的决定因素包括微管、转录因子网络和细胞分裂素通路，这些通路控制WUSCHEL（WUS）表达、生长素介导的新原基定位等^[20]。

许多转录因子控制分生组织的形成和去分化。转录抑制因子WUS和WOUND INDUCED DEDIFFEREN-TIATION（WIND）是维持干细胞全能性的驱动力，而TEOSINTEBRANCHED1/CYCLOIDEA/PROLIFERA-TING CELL FACTOR（TCP）是一种转录因子，在茎尖中抑制干细胞全能性^[21]。

在对来自玉米的未成熟胚胎外植体（A188基因型）的时间动力学研究中，我们进行了全转录组RNA 测序^[22]。应激相关基因（如谷胱甘肽-S-转移酶和类胚蛋白）和激素转运基因（pin）的表达增加了8倍以上。此外，与胚胎生长起始相关的基因（如转录因子和受体样激酶）也会随着时间的推移而上调。通过研究过程中调控基因的大致情况，可以建立协调基因表达的模式和模型，以便更好地了解玉米胚胎培养起始的早期步骤^[22]。

3 培养条件

虽然在愈伤组织培养中，干细胞的概念得到了充分的考虑，但愈伤组织培养不是从孤立的单个细胞发展而来，而是从异质结构组织而来的（图1）。然而，愈伤组织培养很均匀，足以使微繁殖产生相同的带有所需特征的植物副本。维持愈伤组织培养的实验室条件因物种而异，需要在每个个案中加以详细说明。愈伤组织培养产生的一个例子如图1所示。外部因素如光、温度、培养基的pH值和培养物的通气情况影响次生代谢产物的生物合成。通常，愈伤组织在在固体琼脂培养基上进行培养，培养基中添加特定营养素、盐、维生素和元素（如氮、磷和钾）。一般来说，高浓度的铵离子会抑制次生代谢产物形成，而铵态氮的降低会增加次生代谢产物。无机磷酸盐对光合作用和糖酵解至关重要。高磷酸盐水平通常促进细胞生长和初级代谢，而低磷酸盐浓度有利于次生代谢产物形成。许多次生代谢产物是由磷酸化中间体形成的，这些中间体随后释放磷酸盐，如苯丙类和萜类化合物。

通常，向培养基中添加前体可促进产物的形成。植物培养物中次生代谢产物的生物合成率一般较低，需要进行强化以满足商业目的。向培养基中添加前体分子通常会促进产物的形成。大多数次生代谢产物的生物合成由几种酶的多步反应组成。可以通过刺激酶促合成链反应中的任何一步来增强产物的形成。

典型的培养基已经发展得很成熟，如MS培养基、怀特培养基（Whitersquo;s media）和木本植物培养基^[23–25]。在大多数情况下，必须将特定的植物激素添加到培养基中以促进愈伤组织生长。为了优化次生代谢产物的生产，需要采用双培养基法：一种培养基用于良好细胞的生长，另一种用于良好次生代谢产物的形成。

愈伤组织的形成或体细胞胚胎的发生由植物激素如植物生长素、细胞分裂素和赤霉素驱动。从愈伤组织再生成为整株植物的过程被称为器官发生或形态发生。在这个过程中，也需要特定的激素。愈伤组织中激素-淀粉的比例与植物中相应比例的相似性是胚胎发生和器官发生的重要决定因素^[26]。生长因子如丙酮醛和抗坏血酸，可改善体外器官发生缺陷^[27]。

胚胎和胚后发育过程都受到植物激素影响，通过外植组织的遗传和表观遗传机制以及愈伤组织的形成来调节重编程、全能性和分化^[28]。愈伤组织培养物可分为胚性或非胚性。胚性愈伤组织培养物含有分化的胚胎感受态细胞，它能再生完整的植物；非胚性愈伤组织含有均质的去分化细胞，用于产生次生代谢产物。悬浮细胞培养物经常用于特殊设计的生物反应器中的大规模培养。

愈伤组织的胚胎发生与植物冠瘿瘤的形成之间存在显著的相似性。因此，植物肿瘤中的分子调节过程在一定程度上可与愈伤组织培养中的分子调节过程相媲美。在肿瘤发生过程中，将细菌基因组注入宿主基因组中，这激活了植物激素积累的正常通路，并改变了植物对植物激素的细胞反应。植物激素与其细胞受体结合，导致下游基因的活化表达，或者即使没有植物激素，T-DNA也会刺激植物细胞生长^[29]。

图1：黄花蒿愈伤组织的培养。（a）黄花蒿植株；（b）MS98培养基中黄花蒿的叶片；（c，d）愈伤组织在黄花蒿的叶片和叶柄部位生长12 d后，（c）图中的箭头表示坏死组织；（e）愈伤组织在黄花蒿的叶片和叶柄部位生长19 d后；（f）永久愈伤组织培养物；（g）在MS液体培养基中的黄花蒿愈伤组织单细胞悬浮液。MS：Murashige和Skoog。

图1.

4 生产用于治疗的次生代谢产物

4.1具有生物活性的植物化学物质

许多愈伤组织培养的应用具有商业前景，本文将从4个方面详细地讨论：①生产用于治疗的次生代谢物；②生产治疗性抗体和其他重组蛋白；③生产通过愈伤组织再生的农作物；④通过相同的方式生产园艺植物。愈伤组织培养物可用于医疗、化妆品、食品和相关行业中次生代谢产物的可持续大规模生产。药用植物的愈伤组织培养物产生具有生物活性的植物化学物质，可用于治疗多种疾病（如癌症、心血管疾病、神经退行性疾病、传染病等）。此外，生产的化学物质似乎不局限于某些化学类别，而是具有广泛的化学品种（表1^[30–78]）。图2给出了一个例子。由于植物化学物质可以直接从愈伤组织中提取而不牺牲整个植株，因此愈伤组织技术有助于保护珍稀濒危植物物种，并在体外产生足够量的次生级代谢产物。愈伤组织培养物也可以转化为单细胞悬浮培养物，在震荡培养瓶中或生物发酵剂中生长，从而产生所需的次生代谢产物^[80]。这使得其生长在受控的条件下，不受各种环境因素、季节变化、微生物疾病、害虫和地理限制的影响。因此，可以生产具有恒定高质量的次生代谢产物。

愈伤组织和悬浮培养物承载着整株植物的全部遗传信息，具有次生代谢产物生物合成的全能性。此外，组织培养技术为操纵植物细胞生物合成途径，生产具有改良特征的次生代谢产物的衍生物推向市场提供了可能^[80]。此外，生物转化反应可用于将特定底物转化为所需的最终产物。

分离和纯化次生代谢产物的化学制备技术在植物细胞培养物和整株植物中是相同的。如果生成的产物被释放到培养基中，那它们很容易被分离；如果它们被储存在液泡中，则必须破坏植物细胞的质膜和液泡膜（如通过如二甲亚砜等渗透剂）。为了优化所需植物化学物质的生产，必须扩大其生物合成规模，并尽量减少不需要的副产物的合成。形态分化和成熟有利于特定细胞中次生代谢产物的生物合成。

表1通过来自选定药用植物的愈伤组织培养物产生的植物化学物质