泡腾和石墨化多壁碳纳米管天然抗氧化剂辅助萃取的超高高效液相色谱-电化学检测和四极杆飞行时间串联质谱。外文翻译资料

泡腾和石墨化多壁碳纳米管天然抗氧化剂辅助萃取的超高高效液相色谱-电化学检测和四极杆飞行时间串联质谱。

原文作者 Shu-Ling Wang, Xiao-Qing Pang, Jun Cao, Wan Cao, Jing-Jing Xu, Qiong-Yao Zhu,Qian-Yun Zhang, Li-Qing Peng中国杭州（邮编310036）杭州师范大学材料化学与化学工程学院

摘要：本文首次开发了泡腾和石墨化多壁碳纳米管辅助微萃取技术，用于山楂中抗氧化剂的提取。该方法的核心是使用由磷酸二氢钠，碳酸钠和微米级羧基石墨化多壁碳纳米管（萃取吸附剂）组成的泡腾片。在这项研究中，超高效液相色谱联用电化学检测和四极杆飞行时间串联质谱进行定性和定量分析山楂食品中的目标分析物。系统地评估了几个实验因素，如泡腾盐的量，吸附剂，洗脱时间和洗脱溶剂。在优化条件下，得到了R值优于0.9980的良好线性关系。信噪比为3：1的检测限为0.01至0.18 ng / mL。这些结果表明，该方法可能是未来食品分析中备选和有前景的样品制备工具。

关键词：抗氧化剂 ；石墨化多壁碳纳米管； 泡腾辅助微萃取山楂 ；霍桑四极杆飞行时间串联质谱 ；超高效液相色谱电化学检测

1. 引言

碳纳米管（CNTs）是Iijima于1991年首先发现的新型和有趣的碳纳米材料[1]。由于碳纳米管具有极大的比表面积，独特的结构和显着的物理化学特性，因此吸引了越来越多的研究兴趣，并被用于多种分析领域[2]。根据纳米管壁碳原子层的原理，将碳纳米管分为两类：单壁碳纳米管（SWCNTs）和多壁碳纳米管（MWCNTs）[3]。其中，石墨化多壁碳纳米管（GMWCNTs）是在2800℃下热处理相关的纯化碳纳米管的惰性气体下进行的，时间约为20 h，由于其微观和宏观结构特征，引起了学科界的广泛兴趣。另外，由于较小的表面缺陷，它们表现出更高度有序的石墨结构，更高的电化学稳定性，更完美的晶格和更高纯度的原始多壁碳纳米管。近年来，大量研究报道了GMWCNTs在吸附去除污染物[4]，耐用的阴极催化剂[5]和乙腈提取物的分散清洗[6]等方面的潜在应用，因为它们的高表面积和内部体积，机械强度，稳定性和建立的pi;—pi;可能性交互[7]。微量提取技术作为常见的样品制备工具，是经典样品处理向简单化和小型化发展的竞争性分析方法[8]。包括固相微萃取和液相微萃取在内的多种技术在食品[9]，药物[10]，环境[11]和生物样品[12]中广泛应用。在所有可用的技术中，泡腾辅助微萃取（EAM），基于泡腾反应引入的分散力，由Lasarte-Aragoneacute;s等人开发。 [13]。在提取过程中，当将片剂组分加入含水样品中时，通过二氧化碳源产生吸附剂的分散。该方法快速，有效，已成功应用于从植物，环境和食品样品中提取痕量化合物[14,15]。然而，到目前为止，还没有关于使用GMWCNT作为EAM中的吸附材料的文章，以提取这些与真实样品不相容的目标分析物，特别是对于食品

近年来，高效液相色谱（HPLC）与电化学检测（ECD）相结合来检测目标分析物受到越来越多的关注。 ECD具有灵敏度高，选择性好等优点，可以为分子的理化性质提供信息，并用于不同样品中电活性化合物的测定[16]。目前，广泛使用3-5mu;m粒径的色谱柱，保留了极性化合物。经典HPLC-ECD的主要局限性在于样品体积大，分析时间长[17]。因此，为了提高色谱分离的效率，采用超快速液相色谱 - 电化学检测系统， m粒度已经被开发出来，其性质在近期的报道中被系统地研究[18,19]。然而，据我们所知，还没有任何关于使用超高效液相色谱 - ECD（UHPLC-ECD）和微量萃取的食品测量的报道。因此，开发基于UHPLC-ECD的简单准确的方法对食品样品中的电化学活性分析物进行分析是有意义的。

山楂（Crataegus pinnatifida Bge。）是罗汉family科的成员之一，在亚洲，欧洲和北美地区被广泛用作食品和医用材料[20]。最近的研究表明，酚类化合物是山楂活性成分的主要成分，已被证实具有显着的抗氧化活性[21,22]。因此，从山楂中提取和定量测定抗氧化酚类化合物对于生理学和药理学研究是非常重要的。在这项研究中，首次提出了一种简单快速的拆分分析方法，使用泡腾和GMWC-NTs辅助微萃取，用于UHPLC-ECD提取山楂样品中的抗氧化剂。在这种情况下，使用二氧化碳释放作为分散力来产生羧基石墨化多壁碳纳米管（GMWCNTs-COOH）的分散，避免使用有机溶剂或表面活性剂。对实验变量进行了优化和讨论，包括泡腾剂用量，洗脱时间，洗脱溶剂，吸附剂用量和样品溶液的pH值。最后，该方法被用于测定复合食用山楂中抗氧化剂的含量，并采用四极杆飞行时间串联质谱（Q-TOF / MS）对这些样品中的目标分析物进行鉴定和鉴定。

2.试验

2.1 化学试剂

羟基石墨化多壁碳纳米管（GMWNTs-OH），羧基多壁碳纳米管（MWCNTs-COOH），GMWNTs-COOH和GMWNTs与o.d. 8-15 nm，长度为50mu;m，由南京济仓纳米科技（南京）公司提供。中国天津阿尔法中国有限公司提供的1-3nm内径（id）times;3-20nm外径（od）长度为0.1-10mu;m的MWCNTs。色谱级磷酸二氢钠和磷酸购自上海西格玛奥德里奇贸易有限公司（中国上海）。甲醇，乙腈和异丙醇（HPLC级）由泰迪亚公司.（费尔菲尔德，美国）提供。从杭州化学试剂有限公司获得分析纯的乙醇，乙酸乙酯，氢氧化钠，二水合磷酸二氢钠，无水碳酸钠和丙酮（中国杭州）。净化水（中国杭州娃哈哈集团有限公司）用于实验。直径为50mm的0.2mu;m一次性尼龙膜购自金腾实验室设备有限公司（中国天津）。从上海惠而碧医疗科技有限公司（中国上海）收集纯度高于98％的儿茶素，绿原酸，咖啡酸，表儿茶素，原儿茶酸，阿魏酸，金丝桃苷和异槲皮苷等检测标样。标准溶液是将每种化合物溶解在浓度为500mu;g/ mL的色谱级甲醇溶液中，并在4℃避光保存。从当地的药店（中国杭州）购买山楂果实，将山楂食品（Sweetend roll，山楂片，山楂饮料，益心山楂饮料，无极旺山楂饮料）由中国杭州本地人（超市）提供。

2.2 仪器和色谱条件

使用配备有二元溶剂输送泵，自动取样器，恒温柱室和安泰克SDC ECD（安泰克，荷兰）的安捷伦1290液相色谱系统（安捷伦科技，圣克拉拉，CA）。使用安捷伦SB-C18色谱柱（1.8 mu;m，4.6 mm内径times;50 mm），在35℃下进行色谱分离，流速为0.5 mL / min。流动相由含5％（v / v）甲醇（pH3.5）流动相A的25mM磷酸二氢钠缓冲液和含80％（v / v）甲醇的25mM磷酸二氢钠缓冲液作为洗脱液B组成。流动相是由磷酸调整的。使用以下梯度程序：0-8.5分钟，20-20％B; 8.5-9.0分钟，20-40％B; 9.0-15.0分钟，40-40％B; 15.0-17.0分钟，40-100％B。注射量为1mu;L。在Ecell = 0.70V的电池电势下进行配备有优越先进数字滤波和一个流动池的ECD。将检测器设置在相对于Ag / AgCl参考电极的500nA范围内。

该UHPLC系统连接到6530 Q-TOF质谱仪（安捷伦，技术，圣克拉拉，CA）上，该仪器配备了负离子模式下的常用ESI源。 使用高纯度氮气（N2）作为雾化气体。 优化参数如下：干燥气温度350℃; 雾化器气体压力，45 psi; 毛细管电压，3500 V; 碎片子，175V; 八极RF，750 V; 撇渣器电压，65 V; 干燥气流量为12L / min，冲洗能量为15-25V。定性分析时，流动相中的盐变为挥发性醋酸铵，质谱仪以目标MS / MS扫描模式运行。 使用Mass Hunter软件（版本B05.00定性分析）进行数据处理，质量范围记录在m / z 100-700的范围内。

2.3 山楂样品的制备

KQ-100B型超声波清洗机（昆山超声波仪器有限公司）用于山楂的提取（频率40kHz，功率100W）。 山楂液体样品（饮料）直接用于本研究。 因为山楂固体样品含有疏水性和亲水性化合物，70％的甲醇溶液适合于通过优化萃取溶剂来萃取目标分析物。 将固体样品按如下方法制备：将山楂果粉或山楂粉（研磨后）2g转移至50mL锥形瓶中，用15mL 70％甲醇溶解。 将烧瓶盖好，然后置于超声水浴中60分钟。 水的温度设定在60℃。接下来，样品冷却至室温，在提取过程中用70％甲醇补偿失重。 过滤后，残留物用15 mL 70％的甲醇在相同的条件下超声提取60 min。 然后将两个滤液合并，并在色谱分析之前保存在冰箱中。

图1.泡腾片剂和微萃取方法的示意图。

2.4 泡腾片制剂

将两百毫克磷酸二氢钠水溶液和100毫克无水碳酸钠混合在一起，预先在90℃烘箱中干燥3小时。 然后，加入10mgGMWCNTs-COOH，并将固体在玻璃磨中研磨直至获得均匀且细的粉末。 用压片机将混合物压制15分钟，并储存在惰性气氛中或立即用于萃取（图1）。

2.5 微萃取程序

微萃取过程如图1所示。将泡腾剂（1.2cm ID）置于250-mL烧杯中。 接下来，200毫升的解决方案包括199.95毫升水和50mu;L的标准溶液（500mu;g / mL）或样品被添加到机器人。 随后，泡腾化合物的溶解和反应发生，吸附剂被二氧化碳（CO2）有效地分散，改善了模型分析物与GMWCNTs-COOH之间的相互作用。 在此之后（10分钟），含水样品通过0.45mu;m的尼龙膜，随后真空干燥。 将富含目标化合物的GMWCNTs-COOH转移到空的玻璃注射器（10mL）中。之后，加入3mL乙醇，并与尼龙膜紧密接触。 洗脱溶剂用超声水浴7.5分钟，然后通过0.45mu;m圆柱形过滤器去除潜在颗粒。 得到的溶液在95℃干燥的加热器中干燥，然后将残余物重新溶解在100mu;L的乙醇中。 最后，将乙醇溶液在离心机中以13,000rpm离心5分钟，并将1mu;L注入UHPLC-ECD系统用于分析。

3.结果与讨论

3.1 抗氧化剂的鉴定

通过UHPLC-Q-TOF / MS对抗氧化剂吸食食品进行鉴定和确认。 标准品和食品的总离子流色谱图均为负离子模式，大部分组分呈现准分子离子[M-H] - 。 通过碰撞诱导的解离来检测MS / MS的信息，并且测试分析物的破碎行为显示在图2中。通过比较其色谱保留时间和MS / MS谱与实际标准中的八个分析物吸附树样品。 表1总结了所表征的化合物的质谱数据，包括配方，前体离子实验分子量，碰撞能量和MS / MS测定的主要碎片。

如图2A所示，原儿茶酸在m / z 109.03处产生主要碎片离子。 这种丰富的产物离子是由于中性分子二氧化碳（CO2）的流失造成的。 儿茶素的负电喷雾质谱（图2B）显示在m / z = 289.07处的[M-H] - 离子，在m / z = 150.94处具有基峰，在m / z = 137.02和182.67处观察到其他片段。 主要碎片离子为m / z 150.94，对应于C 7 H 6 O 3的损失。小碎片m / z 137.02的存在是由于C 8 H 8 O 3从[M-H] - 。虽然在这个谱图中不是主峰，但在m / z = 182.67处的产生表明儿茶酚分子从儿茶素分子离子处被切断。绿原酸给出[M-H] - 离子m / z 353.08元素组成为C 1​​6 H 17 O 9。在MS2谱中，观察到对应于C 9 H 6 O 3损失在m / z 191.05处的特征离子（图2C）。咖啡酸在m / z 179.03处产生[M-H] - 离子，并且在C-C和COOH基团之间的单键裂解得到m / z为135.04的主要碎片[M-H-44]（图2D）。在负离子模式下，表儿茶素通过损失C 9 H 9 O 4和C 2 H 4 O产生m / z为107.95和m / z为245.05的两个主要碎片离子（图2E）。从图2F可以看出，阿魏酸在m / z = 193.05处显示去质子化的离子。相对较小的峰值是对应于来自母体化合物的连续CH 3损失的m / z 178.02。 m / z 134.03处的主要碎片离子是由[M-H] - 失去CH3和CO2而产生的。在羟基（OH）失去之后m / z 134.03进一步碎裂至m / z 117.03。在山楂样品中也鉴定了皂苷。该谱显示了涉及糖部分[M-H-C 6 H 10 O 5] - 的裂解的特征性片段化（图2G）。图2H显示了在20V的碰撞能量下异槲皮素的质谱，并且在m / z 463.09处观察到前体离子。丰度产量为m / z 151.94，相当于C 14 H 15 O 8的损失。

3.2. 泡腾盐的量

盐在EAM过程中盐浓度的适当选择对泡腾活性和提取效率具有关键作用。在本研究中，通过使用碳酸钠和磷酸二氢钠（比例1：2）在水性样品中的组合，实现了中等的动能，并且评估了这些混合盐的影响在不同的量，范围从200到400mg。如图3A所示，对于所有的分析物，当泡腾片中的盐量从200mg增加到300mg时，提取收率提高。这种行为的一个可能的解释是在水溶液中加入更多的泡腾盐可以产生更多的二氧化碳来源，以帮助提取溶剂的分散和提高目标溶质的转移，从而提高提取效率[15]。然而，随着盐含量的进一步增加，峰面积减少，当泡腾剂浓度超过350mg时，大部分化合物的

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