采用高效液相色谱-二极管阵列检测-质谱联用技术与2,2-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-磺酸）二铵盐法比较了雪菊（Coreopsis tinctoria Nutt.）不同部位的抗氧化活性和对其天然抗氧化剂进行了鉴定外文翻译资料

采用高效液相色谱-二极管阵列检测-质谱联用技术与2,2-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-磺酸）二铵盐法比较了雪菊（Coreopsis tinctoria Nutt.）不同部位的抗氧化活性和对其天然抗氧化剂进行了鉴定

作者：L.X. Chen ^a,1, D.J. Hu ^a,1, S.C. Lam ^a, L. Ge ^a, D. Wu ^b, J. Zhao ^a,lowast;,Z.R. Long ^c, W.J. Yang ^c, B. Fan ^d, S.P. Li ^a,lowast;

单位：^a State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine, Institute of Chinese Medical Sciences, University of Macau, Macao

^b China Science and Technology Exchange Center, Beijing 100045, China ^c Xinjiang Uygur Autonomous Region Product Quality Supervision and Inspection Institute, Urumqi 830011, China

^d Urumqi Jiangqi Agriculture Development Co. Ltd., Urumqi 830011, China

专业 食品质量与安全 学生姓名 姚 雯 华

指导老师姓名：徐 茂 军

摘要：雪菊（Coreopsis tinctoria Nutt.）是一种世界闻名的花茶原料，因其具有抗氧化活性和独特的风味等有益的保健作用而越来越受到人们的关注。在本研究中，高效液相色谱-二极管阵列检测-质谱联用（HPLC-DAD-MS）和采用2,2-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-磺酸）二铵盐（ABTS）法对不同雪菊样品中抗氧化剂的含量进行了比较和鉴定。结果表明，雪菊的抗氧化能力最强，茎抗氧化能力最低。检测到14个具有抗氧化活性的峰，初步确定为3,4rsquo;5,6,7-五羟基黄烷酮-O-己糖苷、绿原酸、2R-3rsquo;4rsquo;,8-三羟基黄烷酮-7-O-葡萄糖苷、黄诺马苷、紫铆黄素-7-O-beta;-D-吡喃葡萄糖苷、异奥卡宁、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、3rsquo;,5,5rsquo;,7-四羟基黄酮-O-己糖苷、马里甙、金鸡菊甙、1,3-双咖啡基奎宁酸、金鸡菊苷、奥卡宁和乙酰马里甙，并将紫外光谱、保留时间、质谱数据与标准品或文献数据进行比较。雪菊中的抗氧化剂与我国著名传统饮料菊花中的抗氧化剂存在较大差异，表明雪菊可能是一种具有明显抗氧化活性的草本茶原料。

关键词：两色金鸡菊； 抗氧化活性； HPLC； 基于ABTS的在线分析

1.引言

自由基的过量产生可诱发多种人类疾病，如糖尿病、癌症、中风、类风湿性关节炎和动脉粥样硬化^[1-3]。抗氧化剂能缓解氧化应激，对人体健康有益^[4]。然而，一些目前使用的合成自由基清除剂已经被证实有多种副作用^[5,6]。因此，功能性食品成为一种很有前景的天然抗氧化剂来源^[7,8]。

Coreopsis tinctoria是菊科植物，原产于北美，现已遍布世界各地。在中国，它在位于欧亚大陆桥中心的昆仑山雪线（3000米以上）附近被发现^[9,10]。因此，在中国也被称为雪菊（图1）。雪菊作为一种药茶或药物，在中国和其他国家其在用于治疗糖尿病、腹泻和出血等疾病的方面有着悠久的历史。药理研究表明雪菊具有多种活性，其中抗氧化活性最为关注^[3,12-14]。事实上，已有几项研究报道了雪菊提取物的抗氧化活性^[15,16]。然而，究竟是哪种化合物导致了这种效果还不得而知。本研究采用HPLC-DAD-MS结合ABTS在线分析方法，对中国不同地域雪菊不同部位的抗氧化活性进行了研究和比较，也对雪菊中的抗氧化剂进行了鉴定。

图1.雪菊生长环境（A），雪菊花植株（B），雪菊花的采摘（C），雪菊原材料（D）。

2.材料与方法

2.1.材料与试剂

采集了雪菊（Coreopsis tinctoria Nutt.）的花、芽、种子、叶和茎的不同部位。雪菊的其他花样分别来自新疆克里阳、老叶克和阿叶。详细的样本信息如表1所示。这些样本的凭证标本存放在中国澳门特别行政区澳门大学中医研究所。

表1.分析的样本的汇总

ABTS采购自国际实验室（加利福尼亚圣布鲁诺）。过硫酸钾产自Fluka（德国塞尔策）。绿原酸（ge;98%）购自阿拉丁（中国上海）。本实验室对Marine和奥卡宁（ge;98%）进行了分离纯化，并根据质谱和核磁共振数据确定了其结构。高效液相色谱级甲酸、乙腈和乙醇购自Merck公司（德国达姆施塔特）。尼龙膜过滤器（0.45 mu;m）购自Millipore（马萨诸塞州比尔里卡）。用Millipore Milli Q-Plus系统（Millipore，马萨诸塞州比尔里卡）制备去离子水。

2.2.样品提取液的制备

将干燥的样品粉（0.1 g，40目）和2 mL乙醇-水（55:45，v/v）转移到5 mL硼硅酸盐玻璃萃取容器中。在Multiwave 3000（Anton Paar GmbH，奥地利格拉茨）中进行微波辅助提取，在400 W和80℃条件下进行5 min，然后用溶剂补偿提取液的失重，然后在5000 times; g条件下离心5 min。在离心后，上清液用0.45 mu;m滤器过滤以便进一步分析。

2.3.ABTSbull; 溶液的制备

ABTS自由基阳离子（ABTSbull; ）由ABTS溶液（7 mM水溶液）与2.5 mM过硫酸钾（最终浓度）在4℃的黑暗溶液中反应12 h产生。然后将ABTSbull; 原液用乙醇稀释32倍，在750 nm处吸光度约为1.0，在黑暗中至少可稳定保存2 d。

2.4.HPLC-DAD-MS结合ABTS检测

HPLC-DAD-MS和基于ABTS的检测方法参考我们之前的报道^[7,8,17]。采用Agilent 1100系列（Agilent Technologies）液相色谱，配有真空脱气器、四元泵、自动进样器和二极管阵列检测器（DAD）。分离采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm times; 150 mm，5 mu;m），温度35℃，基于最佳分辨率（数据未显示）。0.05%甲酸溶液（溶剂A）和乙腈（溶剂B）以1 mL/min的流速梯度洗脱：0-20 min，15%B-21%B；20-50 min，21%B-40%B；50-70 min，40%B-70%B，进样量5 mu;L，检测波长275 nm。稀释ABTSbull; 溶液流速设置为0.5 mL/min。任何ABTSbull; 溶液初始颜色的漂白都在750 nm处检测到一个负峰。

qTOF-MS系统（Synapt G2S，Waters，马萨诸塞州米尔福德）配备电喷雾电离源（ESI），以负离子模式工作，基于高分辨率MS数据进行峰识别。在全扫描模式下，质量范围设置为m/z 100-1500。最佳毛细管电压为2500 V，锥形电压为30~50 V。脱溶气（氮气）流量设置为900 L/h，锥形气流量保持为10 L/h。脱溶温度设置为350℃，源温度设置为120℃。扫描时间和扫描间延迟分别设置为0.4 s和0.1 s。所有数据均通过LockSpray精确质量数质谱电离源接口使用独立的参考锁质量获取，以确保质谱分析的准确性和重现性。以亮氨酸脑啡肽为对照品（[M H] = m/z 556.2771和[Mminus;H]^minus; = m/z 554.2615），浓度为0.2 ng/mL，流速为100 mu;L/min。数据以质心模式采集，LockSpray频率设置为10秒，平均扫描10次以上进行校正。并对两个高强度离子碎片的MS²数据进行实时智能分析。

图2.不同雪菊样品的高效液相色谱图和ABTS在线检测图谱（抗氧化检测为阴性），S1-S11与表1相同。

图3.雪菊中已鉴定的化合物的化学结构。1. 3,4rsquo;,5,6,7-五羟基黄烷酮-O-己糖苷，2. 绿原酸，3. 2R-3rsquo;4rsquo;,8-三羟基黄烷酮-7-O-葡萄糖苷，4. 黄诺马苷，5. 紫铆黄素-7-O-beta;-D-吡喃葡萄糖苷，6. 异奥卡宁，7. 槲皮素-7-O-葡萄糖苷，8. 3rsquo;,5,5rsquo;,7-四羟基黄酮-O-己糖苷，9. 马里甙，10. 金鸡菊甙，11. 1,3-双咖啡基奎宁酸，12. 金鸡菊苷，13. 奥卡宁，14. 乙酰马里甙。

图4.黄诺马苷（黄烷酮，4）和马里甙（查耳酮，9）的碎裂途径

表2.雪菊中14种成分的质谱和紫外光谱分析数据

^a通过与参考标准的比较，明确了第2、9、13个峰，其中第14个峰在雪菊中首次出现。

^b片段离子[^1,3A]^minus;的结构信息如图4^[11,23]所示。

2.5.精密度、重复性、稳定性和萃取回收率

根据我们之前的工作^[7,18,19]，选择日间变化来确定所开发的分析方法的精密度。以S1为代表的提取液，连续3天重复分析。在3个水平（0.08、0.1和0.12 g）进行重复性评价，每个水平的样品提取3次并进行分析。分别在0、2、4、8、12、24、48 h对样品进行稳定性测试和分析。提取时，S1样品提取3次，计算第1次提取液总峰面积与3次提取液总峰面积之和的比值。

表3. 14个化合物的日间变异、重复性和稳定性（RSD，%）

2.6.统计数据分析

集群分析是将一组对象进行分组的任务，这种分组（称为集群）中的对象彼此之间（在某种意义上）比其他分组（集群）中的对象更相似。层次聚类（也称为层次聚类分析或HCA）是一种聚类分析方法，旨在构建一个层次的集群。在本研究中，采用HCA评估样本相似性，采用SPSS 16.0 for Windows软件（SPSS Inc.，美国伊利诺伊州芝加哥）。采用一种名为群间连锁的方法，选择模式相似性度量——欧氏距离作为度量^[20]。

3.结果与讨论

3.1.雪菊抗氧化活性研究

采用该系统对11份雪菊样品进行了分析，共检测出14个主要抗氧化活性成分（见图2），结果表明雪菊具有明显的抗氧化活性。

3.2.雪菊中抗氧化剂的鉴定

在雪菊中检测到的抗氧化剂的14个峰（图2）中，通过保留时间、紫外光谱和质谱数据与标准品的数据比较，确定了其中的3个峰（峰2、峰9和峰13）。峰1，3-8和12初步确定为3,4rsquo;,5,6,7-五羟基黄烷酮-O-己糖苷（1），2R-3rsquo;4rsquo;,8-三羟基黄烷酮-7-O-葡萄糖苷（3）、黄诺马苷（4）、紫铆黄素-7-O-beta;-D-吡喃葡萄糖苷（5）、异奥卡宁（6）、槲皮素-7-O-葡萄糖苷（7）、槲皮素-7-O-葡萄糖苷（8）和金鸡菊苷（12），根据文献数据及其破碎模式（图3）^[11,15,21]，它们的代表性碎片如图4所示，各峰的HPLC-UV-MS/MS数据见表2。

化合物10的紫外最大吸收峰位于414 nm，与橙酮类^[22]的海生菊甙非常相似。MS/MS谱还显示m/z 285（海生菊甙）、m/z 151（^1,3A^minus;）和m/z 135 [^1,3A^minus;-O]^{minus;[11,23]}三个片段。该化合物的质谱分析表明，m/z 447（[mminus;H]^minus;）处存在离子，与海生菊糖苷相容。因此，10号峰被初步确定为金鸡菊苷。

第11峰的一级质谱显示离子位于m/z 515（[mminus;H]^minus;），而MS/MS与绿原酸标准品（2）的谱图非常相似：在m/z 353处检测到一个与咖啡酸分子和绿原酸[mminus;H]^minus;对应的片段离子，并描述为双咖啡酰基奎宁酸的特征。根据m/z 191和m/z 179^[24]离子，在自然界中发现了6种二咖啡酰基奎宁酸的异构体，即1,3-二咖啡酰基奎宁酸（11）。

峰14也表现出典型的查耳酮紫外吸收峰，最大吸收波长为380 nm。在查耳酮结构中观察到离子碎片m/z 287， m/z 269， m/z 151 [^1,3A^minus;]和m/z 135 [^1,3A^minus;-O]<s

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