omega;-转氨酶在光学纯胺和非天然氨基酸生产中的应用

Sam Mathew 和 Hyungdon Yun

韩国庆北市庆山市Yeungnam大学生物技术学院， 712-749

摘要；基于转氨酶具有生产多种光学纯氨基化合物的能力，omega;-转氨酶日益成为一种高效催化剂。已采用多种技术来改进酶在反应系统中不同方面的性质，包括筛选，酶工程技术和开发新技术。该综述总结了使用omega;-转氨酶生产对映体纯胺和非天然氨基酸的各种途径和方法。

关键词：转氨酶；生物催化；手性胺；定向进化；定点突变；去消旋化；动力学拆分；不对称合成；非天然氨基酸

简介

直到20世纪30年代末期，实验资料和数据的不足阻碍了代谢途径的阐明和个体反应的表征。1939年，Braunstein和同事首次使用活体生物组织证明了供体氨基酸和受体alpha;-酮酸间的氨基转移。这激起了研究人员研究转氨反应在生化反应中的作用的浓厚兴趣。后来，Schoenheimer揭示了氨基酸中的氨基转移，从而突出了转氨反应在氨基酸代谢中的关键作用。在Schoenheimer的发现后，转氨酶（TAs）是被最广泛研究的吡哆醛-5-磷酸（PLP）依赖酶。氨基酸从alpha;-氨基酸到alpha;-酮酸的转移是TAs的主要代谢作用，无处不在的转氨反应在所有生物的氮代谢中起着至关重要的作用。转氨酶的反应机制包括两个主要步骤：在初始阶段，PLP作为载体在氨基受体和氨基供体间转运胺和电子。此过程中，质子重排然后PLP可逆地水解为吡多胺-5-磷酸（PMP）。在随后的步骤中，来自PMP的氨基被转移到氨基受体再生PLP（图1）。

基于待转移的氨基相对于底物羧基的位置，转氨酶的大致可分为alpha;-转氨酶和omega;-转氨酶。omega;-TA将氨基供体的氨基转移到氨基受体的羰基部分，其中两种物质中的至少一种不是alpha;-氨基酸或alpha;-酮酸。而alpha;-TAs需要羧酸基团在酮或者氨功能基团的alpha;位，因此反应只能生成alpha;氨基酸。因为它能够胺化酮酸，醛和酮，omega;-TAs更实用。此外omega;-Ta的平衡常数相较于alpha;-TAs更高。omega;-TAs存在不同的异构选择性：（R）-和（S）-选择性。直到最近，他们中的大多数是（S）-选择性。与其他酶如水解酶和脱氢酶相比omega;-TAs反应具有许多理想的特征，包括广泛的底物特异性，高对映选择性，高转换数，且不需要辅因子来促进反应。使用omega;-TAs作为生产光学纯手性胺类化合物一直以来都是研究焦点，因为这些化合物广泛应用于制药，农业和化工。

氨基酸

alpha;-酮酸

胺受体

alpha;-酮酸

酮亚胺

醌型中间物

醛亚胺

图 1 (A)转氨酶反应示意图。(B)转氨酶的详细反应机理。

新型转氨酶的鉴定

产生光学纯化合物的能力主要取决于酶对底物的活性和对映选择性。因此，筛选合适的酶对于有效生产对映体纯的胺至关重要。omega;-TAs的筛选可以大致分为经典和计算方法。鉴定omega;-TAs的传统方法是通过测试微生物的酶活，而计算方法是基于使用算法和工具分析生物数据库来检测omega;-TAs。

经典方法

微生物组成了各种酶的丰富储存库，因为它们需要合成用于代谢活动的各种化合物。从微生物中筛选omega;-TAs的传统方法是通过富集培养然后筛选出高酶活和对映选择性的。含有omega;-TAs的微生物利用胺类化合物作为其代谢活动的氮源的能力。通过利用这种特征，用（S）-alpha;-甲基苄基胺（MBA）作为唯一氮源去检测Klebsiella pneumonia JS2F, Bacillus thuringiensis JS64和Vibrio fluvialis JS17中omega;-TAs的活性，其中V. fluvialis JS17有最高的酶活。后来还从Rhodobacter sphaeroides, Alcaligenes denitrificans Y2k-2, Bacillus megaterium SC6394, Mesorhizobium sp.LUK和Anthrobacter sp. KNK 168中筛选出omega;-TAs。微生物利用（S）-alpha;-MBA，beta;-氨基-n-丁酸，（R）-I-环丙基乙基胺，3-氨基-3-苯基丙酸和仲丁胺分别作为唯一的氮源。

Kroutil及其同事已经准备了超过100种不同细菌品种的冻干全细胞，来鉴定具有良好omega;-TAs活性的菌种。通过使用丙酮酸作为氨基酸受体对这些细胞进行外消旋的alpha;-MBA的动力学拆分。在研究的菌种中，Pseudomonas oleovorans DSM 1045表现出的酶活最高。该反应产生（R）-alpha;-MBA，转化率为50%， gt;99 ee。其他具有好酶活的菌株是Janibacter terrae DSM 13953,Pseudomonas cichorri DSM 50259,Pseudomonas fluorescens ATCC 49838,和Pseudomonas sp.NCIMB 11753. 最近，Tunrner及其同事开发了一种新方法，通过使用D-和L-氨基酸氧化酶来快速检测转氨酶酶活及其对映选择性。此方法中，他们使用氨基酸氧化酶（AAO）氧化丙氨酸到亚胺;在此氧化进程中生成的H₂O₂，通过与邻苯三酚红和辣根过氧化物酶混合来比色检测。

计算方法

由于大型基因组和蛋白质组测序项目的成功完成，过去二十年来生物数据呈指数级增长。相比之下，因为实验研究成本高且耗时导致对蛋白质功能研究较少。由于这种（对蛋白质功能的直接研究）不足导致蛋白功能的研究是基于测序的预测。近年来，计算技术越来越多地用于从数据库中筛选omega;-TAs同时使用BLAST检索预测他们的功能。使用BLASTP筛选omega;-TAs在表1中给出。

表格 1使用BLASTP筛选转氨酶

直到最近筛选的大多数omega;-TAs是（S）-选择性的，而只有一种（R）-选择性酶是已知的：来自节杆菌属的omega;-TAs。最近，Bornscheuer及其同事开发了一种计算机方法来鉴定新的（R）-选择性omega;-TAs（图2）。分析了相关酶包括支链氨基转移酶（BCAT），D-氨基酸转移酶（DATA）和4-氨基-4-脱氧胆酸酯裂解酶（ADCL）的初级结构来确定（S）-或（R）-选择性TAs的基因序列。在T.As的相同亚组中存在DATA和BCAT表明在该亚组内对于T.As的底物识别的灵活性。DATA和BCAT相反的对映选择性是由于活性位点的底物配位差异，其由两个结合口袋构成。如果氨基供体的alpha;羧基与酶的小口袋结合，则产生（S）-对映体化合物。相反，如果alpha;羧基与酶的大口袋结合，则产生（R）-对映体化合物。对这些酶的分析导致了注释算法的发展。通过筛选BCATs, DATAs和 ADCLs，该算法后来用于鉴定来自存在于子组中的5700个序列的21个推定的（R）-omega;-TAs。对推定的（R）-omega;-TAs的活性和对映选择性的进一步研究显示17种酶的阳性结果。后来，这些酶中的七种用于生产光学纯的脂肪族、芳香族和芳脂族胺。Kroutil和同事也使用这些酶中的两种来生成光学纯胺。

结构信息

进化假说

关键突变预测

基于序列基元的标准算法

数据库搜索

已鉴定序列克隆表达

所需酶

图 2使用计算方法筛选假定转氨酶的步骤

酶工程

酶反应的效率主要取决于选取的酶具有高活性、良好的热稳定性、期望的底物选择性和高对映选择性。天然鉴定的酶由于对映选择性和活性差并不总能对众多的化合物产生良好的产率。而且，这些酶由于其在加工条件下的不稳定性，也可能不适合工业规模的生产。酶工程是一个新兴领域，涉及通过突变野生型酶来设计具有所需功能的新蛋白质。这些突变酶是用于工业生产的理想候选者，因为它们不仅提供增强的酶活性而且还提供更好的稳定性和对映选择性。用于改善omega;-TA特征的两种主要技术是（ⅰ）随机诱变和（ⅱ）定点诱变。关于omega;-TA的突变研究及其效果在表2中给出。

表格 2omega;-转氨酶的特性

随机诱变

使用生物催化剂商业生产化合物的主要问题之一是在极端反应条件下酶合成的不相容性。随机诱变（定向进化）作为一种有效方法，已越来越多得用于改善酶的特性使其更加适合于工业生产。与理性设计技术不同，定向进化可以在缺乏详细结构信息的情况下进行。该方法涉及两个主要步骤：（ⅰ）通过随机诱变产生一个基因库（ⅱ）有效筛选具有期望性质的突变体，例如高的对映选择性和改善的活性。根据基因库的大小，有多种技术用于突变体的高通量筛选（HTS）：体内选择（10⁸-10¹⁰变体），体外检测（10⁵ - 10⁶ 变体）和96孔微量滴定板形式（10³-10⁴ 变体）。

定向进化策略用于识别减少了产物抑制的omega;-TA-Vf突变体。这种突变库由易错聚合酶链式反应（PCR）产生，随后使用HTS方法在含有2-氨基庚烷作为唯一氮源且富含2-丁酮作为抑制性酮的富集基本培养基上进行筛选。已鉴定的突变体omega;-TAmla对于脂肪酮例，如2-庚酮显示出明显的底物抑制降低作用。另一种已被鉴定的使用随机诱变方法的突变体omega;-TA-Vf;与野生型omega;-TA-Vf相比，它显示出对3-氨基-3-苯基丙酸的活性增加3倍作用。但是这种酶突变位点没有被报道。向反应混合物中加入CuSO₄/MeOH的染色液，当反应过程中产生的alpha;-氨基酸与铜离子反应时会产生蓝色复合物。基于紫外-可见分光光度计的HTS方法用于检测该颜色，从而鉴定出突变体文库中具有增强活性的突变体。在另一项研究中，使用定向进化方法结合PCR诱变和比色筛选鉴定了来自节杆菌CNB05-01（omega;-TA-Ac）的突变转氨酶，其显示出改善的酶活性和热稳定性。将菌落置于用筛选溶液浸泡的硝酸纤维素纸中，测定溶液由取代的四氢萘胺和丙酮酸钠作为底物组成，其依次产生丙氨酸和取代的四氢萘酮。当暴露于空气时取代四氢萘酮的颜色被用作选择具有改善活性的突变体的鉴别因子。在三轮诱变后，从突变体文库中鉴定出含有17个突变的最佳突变体。所选择的突变体显示出对四氢化萘的负载降低3倍，产物浓度几乎增加5倍，产物还原过程循环时间提高5倍，并且在延长的时间段内提高热稳定性（gt;50℃）。

使用定向进化方法的一个主要限制因素是要筛选庞大的突变库。每代定向进化要筛选10³-10⁶个突变体。最近计算机技术的发展已经改进了小型高效突变库的构建，它包含了更少的冗余序列。使用计算机技术预先筛选突变体文库可以提高定向进化的效率。Voigt及其同事设计了一种计算方法，通过预测突变可能提供更好特征的酶区域来减少定向进化的筛选工作。

定点突变

定点突变是提高酶效率的非常有效的策略。然而，需要酶的详细结构和功能信息才能产生所需的变化。一旦蛋白质的数据库结构可用，合理的设计方法可用于研究酶的各个方面，例如底物特异性，辅因子亲和力，对映选择性和稳定性。在没有实验蛋白质结构的情况下，同源建模可用于预测合理可靠的3D结构，前提是模板PDB结构具有良好的序列相似性（gt; 35％），并且可获得相关的酶序列。

omega;-TA -Vf的同源模型被有效地用于研究其活性位点。该信息后来用于通过定点诱变重新设计omega;-TA -Vf的底物特异性。野生型omega;-TA -Vf对芳香胺具有高活性，而对脂肪胺的活性较差。omega;-TA -Vf同源性模型表明它存在大小两个结合位点。芳族和脂族胺之间酶活性的差异是由于酶的活性位点的不同。通过引入两个定点突变产生两种突变酶：W57G和W47G。这些突变有助于减少疏水相互作用，从而有助于克服对脂肪胺的低活性。这种对脂族化合物的底物特异性变宽并未改变对芳族胺的活性或对映选择性。另一个在omega;-TA –Vf的小结合口袋的位点特异性突变：R415K增强了对芳香族alpha;-氨基酸如苯基甘氨酸和苯丙氨酸的活性。

为增强omega;-TA-Ac对于4-氟苯基丙酮的对映选择性也运用了定点突变。生成了一个omega;-TA-Ac的同源模型，并在三个特定位点进行点突变：Glu326,Val328和Tyr331。由这些突变E326D, Y331C和 E326D/Y331C,产生的三种变体增强了omega;-TA-Ac对4-氟苯基丙酮的对映选择性。有趣的是，另一个变体V328A将对映异构体从（S）-选择性改变为（R）-选择性。然而，改变的对映选择性是底物依赖性的，并且点突变导致（R）-4-氟苯基丙酮的选择性，同时保留（S）-4-硝基苯乙酮的选择性。

在（R）-omega;-TA-117上进行了采用定向进化和合理设计的底物递进方法，以开发出可作为西他列汀合成的生物催化剂的突变体（图3）。

图 3通过使用底物递进方法合成西他列汀改变（R）-omega;-转氨酶的底物特异性：（1）与omega;-TA的活性位点结合的苯乙酮，其由大的结合口袋（L）和小的结合口袋组成（S）。（2）首先

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