水杨酸抑制扩展青霉及对苹果贮藏保鲜的功效外文翻译资料

水杨酸抑制扩展青霉及对苹果贮藏保鲜的功效

原作者：Argus Cezar da Rocha Neto , Caroline Luiz , Marcelo Maraschin , Robson Marcelo Di Piero

关键词：苹果、扩展青霉、采后、水杨酸

摘要：苹果是世界上最常食用的水果之一。青霉病（扩展青霉）是苹果采后的主要病害之一，这使人们广泛应用杀菌剂或研发其替代产品来控制病菌。在此背景下，本研究旨在探讨水杨酸（SA）作为青霉病杀菌剂替代品的潜力，以保护采后苹果果实的理化特性。通过体内和体外实验分别测定SA的抗菌效果。通过将分生孢子直接暴露在不同浓度的SA溶液中，或将扩展青霉接种于果实上，并用2.5mM SA溶液处理果实。SA对果实生理指标的影响是通过测定果实失重率、可溶性固形物含量和可滴定酸度来确定的。此外，采用高效液相色谱法测定了果实中SA的含量。体外实验中，2.5 mM SA能抑制100%的真菌萌发；活体实验中，2.5 mM SA能有效控制青霉病害。此外，高效液相色谱分析表明，SA不会在苹果果实中残留。SA还保持了不同品质类别水果的理化特性。因此，SA可能成为目前防治扩展青霉的商用杀菌剂替代品。

1. 引言

食品工业是世界经济中最突出的产业之一。在巴西，这一行业是市场最重要的领域之一(Chitarra and Chitarra, 2005) ，2012年生产了超过130万吨的苹果(FAOSTAT, Food and Agriculture Organization of the United Nations Statistical Database, 2012) 。此外，采后水果不当处理过程中的机械损伤可能会导致不同类型的腐烂(Vilanova et al., 2014b) ，即使水果在低温下储存，也只能减缓但无法阻止病原菌的生长(Buron- moles et al., 2012) 。

由扩展青霉引起的青霉病是一种对于苹果来说破坏性很强的病害。扩展青霉能产生大量的分生孢子，且传播迅速，造成大量鲜加工水果损失严重(Sanzani et al., 2010) 。它还可以合成对人体健康有害的真菌毒素展青霉素(da Rocha et al., 2014; Wright et al., 2014) 。

由于这些原因，尽管合成杀菌剂会将残留物留在水果和工业洗涤水中(Poulsen et al., 2009; Maxin et al., 2012) ，但它仍然是全球对抗这种病原体的主要防御手段(Zhang et al., 2011)。

随着人们对环境和公共卫生关注的增加(Droby et al., 2009) ，需要采取新的战略来对付扩展青霉，如对杀菌剂活性成分的抗性分离株的选择(Weber and Palm, 2010; Lima et al., 2011)。

水杨酸（SA）被认为是控制疾病的一个很好的替代品。这种分子参与植物中防御化合物的生物合成，并对引起腐烂的各种真菌表现出抗菌作用(Panahirad et al., 2012) ，如梨中的灰葡萄孢菌(Zhang et al., 2008) 、番茄中的尖孢镰刀菌(Mandal et al., 2009) 和苹果中的扩展青霉(da Rocha Neto et al., 2015) 。

此外，SA还可以帮助保持水果的理化性质，例如防止储存草莓的重量减损(Shafiee et al., 2010) 、桃子的变色(Abassi et al., 2010) 以及保持果肉的硬度、总可溶性固形物含量和葡萄的可滴定酸度(Qin et al., 2015) 。

因此，本研究旨在评估水杨酸对苹果果实的保护作用。区别不同品质类别的富士苹果抵抗扩展青霉的能力，保持果实理化特性的能力。

1. 材料和方法

2.1苹果果实、病原体

标准化苹果。选取购买于科普塞拉（圣约阿希姆，圣卡塔林纳，巴西）、存储于冷室内（温度：4°Cplusmn;2°C；湿度：85%plusmn;1%；2个月）的富士苹果，分为三组（1，2，3），再使用0.5%（v/v）次氯酸盐溶液消毒2min后用自来水冲洗，风干。

当至少40%的果皮区域呈现红色且没有晒伤或开放性损伤时，水果被归类为1类，而对于2类水果，这些值为20%的红色表皮区域，最多20%的晒伤和20mm²的开放性损伤。最后，第3类水果的表皮有不到10%的红色，20%以上有晒伤，70mm²的开放性损伤。

扩展青霉是从一种表现出典型蓝色霉菌症状的受感染苹果果实中分离出来的，由Rosa Maria Sanhueza博士鉴定和提供，并储存在植物病原体实验室（巴西弗洛里亚诺波利斯，圣卡塔琳纳联邦大学）的真菌学集合中，代码为MANE 138。将扩展青霉在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）中培养和保存，在25°C下培养两周后备用。在纽鲍尔试验室（血细胞计）的帮助下，将分生孢子悬浮液校准至每次实验的最终浓度。

2.2水杨酸

水杨酸（2-羟基苯甲酸）是从西格玛-奥尔德里奇公司（美国密苏里州圣路易斯市；西格玛产品代码247588）获得的，并借助磁棒和搅拌器在无菌蒸馏水中稀释(Shalmashi and Eliassi, 2008; da Rocha Neto et al., 2015) 。SA的浓度随实验的变化而变化。

2.3水杨酸对扩展青霉的抗菌作用

在凹形载玻片上评测SA的抗菌潜力。为此，在0、1、2.5或5 mm处添加25mu;l的SA溶液，并将25mu;l的扩展青霉分生孢子悬浮液（105分生孢子/ml）添加到滑动腔中。采用无菌蒸馏水作为阳性对照。将凹面载玻片放入培养皿中，在25°Cplusmn;1°C相对高湿度下培养20 h。每次进行四次重复，每一次重复都由凹形载玻片中的空腔表示。用光学显微镜（FWL1500 T，Feldmann Wild Leitz）对100个分生孢子的萌发和20个分生孢子的试管的长度进行了测量。进行了三次重复试验。

2.4 两种贮藏条件下，水杨酸对苹果病害的保护、治疗和根除作用

三类消毒苹果分布在塑料托盘中，使用标准化针头（5 mm深times;1 mm宽）在赤道地区进行注射。每次注射作四次重复；一个托盘中有4个水果代表一次重复。

将三类受损苹果浸泡在无菌蒸馏水或2.5 mM SA溶液中2min，评估SA的保护电位。干燥后，将果实浸入扩展青霉孢子悬浮液（10⁴分生孢子/ml）中2min。通过改变接种水果的顺序，然后浸泡在蒸馏水或SA溶液中，评价其疗效。

最后，通过将受损苹果浸泡在无菌蒸馏水（A）或2.5 mM SA溶液（B）中制备的扩展青霉孢子悬浮液（10⁴分生孢子/ml）中评测根除的潜力。将悬浮液搅拌30min，然后将苹果浸入悬浮液（A或B）中2min。

在第二个实验中，通过将受损苹果（1、2和3类）浸泡在无菌蒸馏水或2.5 mM SA制备的扩展青霉分生孢子悬浮液（10⁴分生孢子/ml）中2min来评估SA的根除潜力。此时还添加了两种处理方法：仅将水果浸泡在无菌蒸馏水中，或仅浸泡在2.5 mM SA中，而不存在扩展青霉分生孢子。将所有悬浮液搅拌30min，然后浸泡水果（2min）。

整个实验过程中，将苹果避光贮藏在高相对湿度的室温（25°Cplusmn;1°C）或冷室（4°Cplusmn;1°C）中。

根据培养条件（分别在25°C和4°C培养4d和10d后进行首次评估），用标准尺每4d或10d测量每种水果病斑直径（cm）。根据病斑直径随时间变化的平均值，在每个托盘中测定病斑生长率如下：LGR = (Sigma;(theta;tminus;theta;t minus; 1)/t)；其中“theta;”表示“t”时的平均病斑直径。结果以cm/d表示(da Rocha Neto et al., 2015) 。

实验结束时，根据苹果的损伤数除以苹果的损伤总数，计算出苹果的发病率，这些损伤呈现出典型的蓝霉菌症状。平均结果以百分比表示。

2.5 体内实验中酸性溶液对扩展青霉的影响

研究了酸性溶液对不同苹果品种青霉病发生率和严重程度的影响。如前所述，标准苹果（1、2或3类）在赤道区受到两次伤害，并浸入无菌蒸馏水（pH7.0）、用0.05 N HCl（pH3.0）或2.5mm SA酸化的蒸馏水中制备的扩展青霉分生孢子悬浮液（10⁴分生孢子/ml）中。将这些悬浮液搅拌30分钟，然后将苹果浸泡2min。在整个实验期间，苹果在高相对湿度、黑暗中、25°Cplusmn;1°C条件下培养。如上文所述，对腐烂的发生率和严重程度进行评估。

• 1. SA对苹果理化特性的影响

根据第2.4节（第二次根除实验）和第2.5节所述的实验，在实验的开始（第0天）和结束（第12天）对10个苹果（1、2或3类）进行物理化学分析。

对水果（WLF）的失重进行量化Tefera et al. (2007) ，在分析天平上对每个水果称重。

可溶性固形物（SS）含量的测定方法参考Dong et al. (2001) ，并进行了修改。在榨汁机（HL3235，Walita）的辅助下，对苹果样品进行研磨，得到粗液体提取物（CLE）。然后在折射计（RT-30atc，instrutherm）中加入10mu;l的CLE，测定SS含量。结果以°Brix表示。

可滴定酸度（TA）的测定方法参考Tefera et al. (2007) ，并经过修改。用无菌蒸馏水（10%）稀释的0.1N氢氧化钠滴定法测定TA含量。将苹果汁的酸碱度碱化至8.2所需的氢氧化钠溶液的最终体积进行TA的相对计算。所得结果以苹果中苹果酸的%表示。

2.7苹果中残留SA的鉴定与定量

首先，三种不同种类的苹果受到侵染，然后浸泡在无菌蒸馏水或2.5 mM SA中制备的扩展青霉分生孢子悬浮液（104分生孢子/ml）中2min。然后，在试验开始（0 h）和结束（80 h）时，对5个具有表皮的果肉盘（直径6 mmtimes;深度4 mm，每次重复约300 mg）进行取样。进行5次重复实验。

根据Schmidt et al. (2012) 的研究，对苹果甲醇提取物中的SA进行了鉴定和定量。将每个样品置于微量离心管中，添加1 ml 80%酸化甲醇（pH2.0），添加1 ml 80%酸化甲醇（pH2.0），然后在普氏组织匀浆机(Bertin Corp., Rockville MD, USA)中浸渍。然后将2毫升80%酸化甲醇加入浸渍液中，在黑暗和冰浴条件下培养1小时。培养后，将混合物浓缩5分钟（6000rpm，4°C）并收集上清液。

通过液相色谱仪（Shimadzu LC-10 A）分析每个样品的等分样品（10mu;L），该液相色谱仪配有一个C18柱（垫片组；250 m mtimes;4.6 m m内theta;，5mu;m粒径，35°C）和一个在280 nm下工作的紫外可见检测器。以水：乙酸：异丁醇（350:1:10 v/v/v）为流动相，流速为0.8 ml/min，采用共色谱法对化合物进行了洗脱，并在相同实验条件下比较了标准化合物（美国没食子酸和水杨酸西格玛-奥尔德里奇）的保留时间。根据没食子酸的标准外曲线（0.5–300mu;l·ml^minus;1；y=35158times;；r²=0.99）进行SA的定量，同时考虑到浓度计算所需的峰面积，得出的值代表每种处理的样品3次注射的平均值。SA的最终浓度以mM表示。

2.8统计分析

实验是在完全随机的设计中进行的，上面描述了每个项目的实验图。数据经Levenes或Cochrans检验，以检查不同处理之间误差的均匀性（单因素和多因素ANOVA分析），然后进行方差分析和相应的F检验（5%）。当F检验结果显著时，Tukey检验的显著性水平为5%。

适当时，使用软件sisvar 5.0进行线性回归分析，根据5%显著性水平下的t检验值，观察最符合结果的数学模型。

所有其他统计分析均使用Statistica 10.0软件进行，图表由软件Prism 5为Mac OS X设计。

此外，在图1中，由于所有实验的对照样品在发病率、严重程度和病斑生长率方面显示出相似的结果，无论应用形式（疗效性的、根除性的或保护性的）有无统计学差异，因此将它们分组为一个单独的结果，以减少信息量。

图一：2.5 mM SA溶液在不同质量类别（1、2和3）苹果中的疗效、根除性或预防性应用，可预防p.expansum发病率（%）、严重程度（cm）和生长（cm/天）。在整个实验期间，苹果在25°C（12天）或4°C（40天）下储存。数据表示平均值plusmn;标准差。不同的大写字母表明不同质量类别水果的应用形式存在显著差异（Tukey，ple;0.05）。在申请表中，各类别之间没有发现差异。

1. 结果和讨论

体外实验结果表明，2.5 mM SA处理可以完全抑制扩展青霉的孢子萌发及芽管生长。但是，随着SA浓度的降低，其抑制效果也降低了，1 mM时抑制植物病原菌的发芽率高达85%（表1）。Yu and Zheng (2006) 发现SA的抗菌活性与其浓度之间存在相关性，他们观察到该化合物仅在0.7 mm以上的浓度下抑制了50%以上的扩展青霉萌发。

表1

暴露于不同剂量SA下的扩展青霉孢子的发芽率（%）和芽管长度（mu;m）。数据显示为三个独立实验的平均值plusmn;标准差。不同的大写字母表示发芽剂量之间的显著差异，而不同的小写字母表示芽管长度的剂量之间的显著差异（Tukey，ple;0.05）。

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