羟基自由基对乳清分离蛋白的胁迫：功能性和流变学特性外文翻译资料

羟基自由基对乳清分离蛋白的胁迫：功能性和流变学特性

摘要：这项研究的目的是检测乳清蛋白功能对氧化自由基的敏感性。乳清蛋白分离物（WPI）在含有0.1mM抗坏血酸，0.1mMFeCl₃和1-10mM H₂O₂的培养基中于20℃孵化3小时，5小时和10小时，生成羟基自由基。蛋白质的溶解度随着H₂O₂浓度和氧化时间的增加而下降（Plt;0.05）。WPI的表面性质，包括乳化性和发泡性，在H₂O₂浓度高达5mM和氧化时间长达5小时时表现出显着的改善（Plt;0.05）。氧化时间越长或H₂O₂浓度越高倾向于降低表面功能。然而，氧化应激虽然减少了胶凝的起始温度对WPI凝胶化有一般的不利影响（硬度，弹性和杨氏模量）。该结果表明氧化对WPI的反作用：不利于流体动力学性质（溶解度，凝胶化），但有利于表面性能（乳化性，发泡性）。

关键词：乳清分离蛋白；羟基自由基；蛋白氧化；功能特性

引言：

乳清分离蛋白（WPI）广泛用于配制食品，包括乳制品，富含肌肉的食品，饮料，焙烤产品和众所周知的拥有焙烤功能和营养特性的小吃店(de Wit 1998; Smithers 2008）。流体动力学性质（如，溶解度和凝胶化）或表面活性（如，乳化性和成膜性）会受到无数外在因素的影响，包括蛋白质的浓度，温度，pH值，离子强度，加热速率，和特定金属离子的存在会影响每个性质的特定功能，（Morr和Ha 1993）。虽然WPI在食品加工的很多方面都作为功能性成分，但由于它可以进行激进介导氧化应激，因此WPI的性能可能会受到特定的氧化条件的影响。在前期的研究中（Cui 等人，2011）发现在室温下氧化，WPI对羟基自由基（bull;OH）非常敏感，这是说明该反应促进了二酪氨酸和羰基化合物的形成和巯基的损失。这些化学变化发生的同时使得蛋白质聚集和结构变化。事实上，通过清除自由基作为抗氧化剂，同时混合（Pena-Ramos等人，2004）个别乳清蛋白，如beta;-乳球蛋白（Elias等人，2005），已被证明其对活性氧敏感。温度似乎是影响蛋白质修饰的程度的重要因素。在早期的研究中发现，在冷藏温度下，WPI中的一些氨基酸侧链基团被bull;OH修改，但蛋白质的热稳定性没有明显改变(Liu等人，2000)。另一方面，Faelig;rgemand等人(1998)研究表明，不同体系中的乳清蛋白与各种氧化还原酶在40°C时可氧化形成不同乳清蛋白的聚合物和低聚物。Mestdagh等人(2011)研究了乳清蛋白与脂质在光诱导氧化过程中的相互作用，发现多不饱和脂肪酸酸刺激蛋白质氧化过程，导致必需氨基酸的降解，蛋白质-脂质加合物的形成和广泛的蛋白质聚集。

因为蛋白质功能与其结构特征密切相关，据推测，如先前研究中所述，自由基应激的WPI的结构修饰会改变蛋白质的功能特性。本研究的目的是检验通过凝胶评估进行的WPI样品，在室温（20plusmn;1°C）下暴露于bull;OH生成系统（HRGS）的粘弹性，乳化性和发泡性。

材料与方法
1.1材料
乳清分离蛋白（基于干重的95.0％蛋白质）获自Davisco Foods International，Inc.，USA，6-羟基-2,5,7,8-四甲基-2-羧酸（Trolox），丁基化羟基苯甲醚（BHA），乙二胺四乙酸（EDTA）和抗坏血酸购自Sigma Chemical Co.（St.Louis），MO，USA），所有其他化学品和试剂均为分析级。使用Kjeldahl分析仪（Kjeltec 2300，FOSS Corporation,Eden Prairie,USA）测定WPI干粉以及下述所有测试溶液中的蛋白质浓度。

1.2蛋白质氧化

如前所述（Cui等人，2011），WPI被氧化应激。简而言之，将WPI悬浮液（20mg/mL蛋白质）在含有0.1mM抗坏血酸，0.1mM FeCl₃和4种水平的H₂O₂（1,2,5和10mM）的条件下20plusmn;1°C温育3天，5天或10小时。最后加入BHA /Trolox/EDTA（各1mM）终止氧化。对照样品（未氧化的）含有不含HRGS组分的缓冲液。在随后的功能测量之前将所有样品冻干。

1.3蛋白质溶解度

将WPI样品在蒸馏水中悬浮（20mg/mL蛋白质），搅拌20分钟，并以10,000times;g离心10分钟。将蛋白质溶解度（百分比）定义为上清液（凯氏（Kjeldahl））的蛋白质浓度除以原始悬浮液的蛋白质浓度，然后乘以100。

1.4蛋白质的乳化性

在室温下通过使用IKA均化器（T18 basic，IKAWerke GmbH＆Co.，Staufen，Germany），将3mL纯大豆油和9mL WPI样品溶液（1mg/mL蛋白质在去离子水，pH7.0）混合，以20,000rpm均质1分钟来制备水包油乳化体系。将制备的乳液立即转移至25mL烧杯中。在指定的后均质化时间内，从烧杯底部0.5cm处取出等量分试样（各50mu;L）并分散到5mL的0.1％十二烷基硫酸钠溶液中。读取500nm处的吸光度。乳化活性指数（EAI）和乳液稳定性指数（ESI）计算如下(Pearce and Kinsella 1978):

其中A₀和A₁₀分别表示乳化后（时间0）和室温静置10分钟后的吸光度（500nm），C是蛋白质浓度（1g/mL），phi;是体积分数（v/v=0.25）的油。

1.5蛋白质的发泡性

根据Sathe和Salunkhe（1981）的方法测量WPI的发泡能力和泡沫稳定性。使用IKA均化器（T18 basic，IKA-Werke GmbH＆Co.，Staufen，Germany）将蛋白质溶液（去离子水中的40mg/mL蛋白质，pH调节至7.0）在16,000rpm下均化2分钟。将搅打的样品立即转移到100-mL圆筒中，读取总体积。发泡能力（FC）和泡沫稳定性（FS）根据以下等式计算：

其中VL，VF₀和VF₃₀分别代表非旋转WPI溶液的体积和搅打后（时间0）或在室温下静置30分钟后泡沫的体积。

1.6凝胶特性

凝胶的纹理轮廓分析（TPA）:将等分试样（各50mL）的WPI悬浮液（100mg/mL蛋白质在100mM磷酸盐缓冲液，pH7.0，含有50mM NaCl）转移到100mL玻璃烧杯中。如初步测试中所确定的，WPI需要少量NaCl（50mM）以形成相对强的凝胶。将烧杯用铝箔覆盖并在80°C水浴中加热30分钟。加热后，将凝胶（仍然在烧杯中）在冰浆中冷却并在2°C冷却器中储存过夜。使用质地分析仪（Model TA-XT2,Stable Micro Systems Ltd,Godalming,UK）进行凝胶的TPA（在室温下平衡1小时）。具体地说，在烧杯中形成的凝胶用平面圆柱形探针（直径=12mm）以120mm/min的十字头速度穿透10mm位移。TPA参数，包括硬度和弹性，使用仪器公司（Stable Micro Systems Ltd.）提供的Texture Expert for Windows（版本1.0）计算。

1.7动态流变特性

在单独的实验中，使用Rheostress RS-150流变仪（HAAKE Messtechnik GmbH,Karlsruhe,Germany）对WPI样品（100mM磷酸盐缓冲液中的100mg/mL蛋白质，pH7.0，含有50mM NaCl）进行动态流变学测试。将样品装入预热至30°C的两块平行板（上板直径=4cm）之间的空间（1mm间隙）中，并用暴露的边缘覆盖一层薄薄的矿物油以防止脱水。在测量开始之前给出3分钟的孵育时间以允许温度平衡。通过以1°C/min的速率将蛋白质溶液从30°C加热至85°C形成凝胶，在此期间样品以1Hz的固定频率以0.122的最大应变以振荡模式连续剪切。应变水平用于确保线性粘弹性范围（应力对应变），其允许足够的测量灵敏度，同时保持凝胶完整性，如初步试验中所确定的。胶凝样品的动态流变性质用剪切储能模量（G，材料的弹性响应）来描述。

2.结果

2.1蛋白质的溶解度

WPI样品的蛋白质溶解度通常随着H₂O₂浓度和氧化时间的增加而降低（Plt;0.05）（图1）。具体而言，对照（未氧化的）WPI（88.4％）的溶解度分别在1mM H₂O₂暴露于HRGS 3,5和10小时后降至78.1％，72.5％和65.9％（Plt;0.05）。在HRGS中孵育3小时，5小时和10小时后，在较高浓度的H₂O₂（10mM）下降低更显着，即分别达到72.6％，69.7％和62.9％（Plt;0.05）。

图1

2.2蛋白质的乳化性

研究表明氧化对WPI形成油包水乳液能力的影响，结果如图2所示。非氧化WPI的EAI和ESI分别为115.5m²/g和91.2％。两种指标均在低浓度H₂O₂和短氧化时间下得到改善。例如，在用1mM H₂O₂氧化WPI样品3小时和5小时后，EAI分别增加7.8％和26.7％（Plt;0.05）。然而，随着氧化时间的延长，乳化活性降低。HRGS对WPI中ESI的影响遵循与EAI类似的模式（图2）。

图2

2.3蛋白质的发泡性

泡沫是双相胶体系统，具有连续的水相或液相以及分散的气态或空气相。非氧化WPI样品能够产生高容量泡沫（发泡能力为222％），尽管泡沫稳定性相对较低（31.0％）（图3）。

图3

2.4纹理轮廓

随着氧化剂浓度和氧化时间的增加，固化凝胶的硬度和弹性下降（Plt;0.05），表明bull;OH的一般有害影响（图4）。氧化凝胶的弱化特别显着，因为当在低于1mM H₂O₂的HRGS中将WPI氧化3小时时，原始硬度（11.5N）下降了67％。

图4

2.5动态流变特性

为了理解氧化如何影响蛋白质基质形成的动力学，对照和氧化应激的WPI样品进行动态流变学测量，监测蛋白质溶胶向三维凝胶网络的转化。如图5所示，WPI的粘弹性图案通过氧化显着改变。

图5

3.讨论

结构特征和表面特性在乳清蛋白在食品加工中的功能行为中起关键作用（Cayot和Lorient 1997）。为了利用该功能，通常使用各种加工方法（加热，酶水解等）和成分技术（NaCl，CaCl₂等）。目的是改变蛋白质结构，以实现最佳蛋白质-蛋白质，蛋白质-脂质，蛋白质-水和蛋白质-风味相互作用（Kinsella和Whitehead 1989）。由氧化自由基引起的蛋白质结构变化，通常是无意的结果，证明对水结合是有害的。特别地，在1-10mM H₂O₂浓度范围内的HRGS中WPI的氧化损害了流体动力学性质，包括溶解度和凝胶化。

溶解度是蛋白质和水通过离子-偶极子和偶极-偶极子力相互作用的结果（Damodaran 2007）。溶解度的损失表明这种力的减弱有利于蛋白质分子之间的结合。如前所述，当H2I浓度增加时，WPI暴露于HRGS时，表面疏水性和浊度增加，而总巯基减少（Cui等人，2011）由于bull;OH修饰导致的疏水缔合和二硫化物交联增加，易于使蛋白质形成可溶性和不溶性聚集体（Liu和Xiong，2000）。此外，二酪氨酸显示在bull;OH stressed WPI中形成（Cui等人，2011），这也可能导致蛋白质不溶解。

另一方面，在低浓度H₂O₂下暴露于HRGS后，WPI的乳化活性增强可以通过考虑结构变化来解释。正如我们之前的研究（Cui 等人，2011）所指出的，当蛋白质样品被bull;OH氧化时，WPI的表面疏水性（蛋白质结构解折叠的指标）显着增加。

参考文献

［1］Cayot, P., amp; Lorient, D. (1997). Structure–function relationship of whey pr

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