响应面法优化超声波辅助提取褐藻酚类物质和抗氧化活性的研究外文翻译资料

响应面法优化超声波辅助提取褐藻酚类物质和抗氧化活性的研究

Thanh T.Dang、Quan Van Vuong、Maria J. Schreider 、 Michael C. Bowyer、Ian A.Van Altena、Christopher J.Scarlett

摘要：本文旨在使用响应面法（RSM）优化超声辅助萃取（UAE）褐藻的总酚含量（TPC）及其抗氧化活性，包括总抗氧化能力（ABTS）、自由基清除能力（DPPH）以及铁还原抗氧化能力（FRAP）的工艺研究。采用Box–Behnken设计原理，研究超声波温度、时间、功率对TPC及提取物抗氧化活性的影响。结果表明，利用响应面法在预测TPC和抗氧化活性（ABTS、DPPH、FRAP）时，R²分别具有0.97、0.96、0.92和0.94，说明RSM是一种准确可靠的预测方法。超声温度和时间对TPC和抗氧化能力有显著影响。超声辅助提取褐藻的总酚含量（TPC）及其抗氧化活性的最佳工艺条件为温度30℃、时间60 min和功率60或150 W。在此工艺参数条件下的TPC和抗氧化活性（ABTS, DPPH, FRAP）的值分别为23.12 （mg GAE g ^minus;1 ）、85.64 （mg TE g ^minus;1 ）、47.24（mg TE g ^minus;1）和12.56（mg TE g ^minus;1）。与传统的提取方法相比，UAE方法的效率更高，提取时间更短，TPC水平更高，抗氧化活性更高。因此，利用RSM进行超声辅助提取，能够有效提取以及分离纯化褐藻的酚类化合物。此外，在食品和医药领域应用中，这种藻类可能是天然抗氧化剂的潜在丰富来源。

关键词：褐藻；褐藻纲；超声波协助提取（UAE）；优化；RSM

引言

黑褐藻（Hormosira banksii）（一种褐藻）（墨角藻目：褐藻类），广泛分布于澳大利亚新南威尔士州沿海地区 （Millarand Kraft 1994）。近年来，海洋资源在寻找天然产品的过程中引起了人们的注意，目的是开发新的药物和健康食品（El Gamal 2010年；Mohamed等2012年）以及海洋藻类被报道为提取生物活性化合物的潜在来源（Gupta和Abu-Ghannam 2011年）。从褐藻中分离出许多代谢产物，其中包括色素（富钴黄素、类胡萝卜素等）、酚类化合物（phlorotannins）、硫酸盐多糖（富科丹）、溴酚和巯基萜类化合物。这些生物活性化合物与抗过敏（Miyake等2006年）、预防心血管疾病（Shi 等2010年）、神经保护效应（Alghazwi 等2016年）等多种健康益处有关，以及抗糖尿病（Okadaetal. 2004年）和针对几种类型的癌症（Cabrita等 2010年；De Souza等2009年；费雷尔等2012年；Kumar 等2013年；Kwak 2014年）。

近年来，传统的提取方法由于产品质量较长、成本高、产品质量下降等原因被认为存在一定的缺陷，而由于潜在的健康和环境问题，有机溶剂的提取必须尽量减少（Azmir 等2013年；Polshettiwar和Varma 2008年）。到目前为止，已经开发出各种新技术来提取藻类中的成分（Kadametal 2013年），如加压液相萃取（PLE）（Onofrejovaacute;等2010年）、超临界流体萃取（SFE）（Tanniou等 2013年）、酶辅助提取（EAE）（Wijesinghe和Jeon 2012年）和超声辅助萃取（UAE）（Roselloacute;-Soto等2015年）。与其他方法相比，UAE因其低能量需求和低溶剂消耗（Chemat和Khan 2011年）而被认为是一种比较有效的方法。超声波可以提高萃取效果，利用超声波可以提高溶剂对材料的渗透性，以及固体和液相之间的接触面面积。此外，超声提取过程的改善与细胞壁的破坏有关，由于空化产生的气泡破裂，导致了细胞壁的粒径减小和质量转移的增强（Wang 等2008年；Maciacute;as Saacute;nchez等2009年；The和Birch 2014年）。在以往的研究中，超声辅助萃取技术的优点和缺点已被广泛应用（Romanik等2007年；Chemat 和 Khan 2011年）。

响应面法（RSM）是一种通过建立统计和数学模型来优化过程或产品的有用技术。这个模型可以通过量化数据来评估多个参数和它们的交互作用，从而减少所需的实验试验次数。因此，与优化过程所需的其他方法相比，它也更快、更经济。

本研究旨在利用响应面法优化褐藻总酚含量及抗氧化活性的提取条件。传统的提取方法也可用于比较其有效性和最佳超声提取条件。本研究的结果有可能被应用于进一步分离和纯化褐藻的酚类化合物。

材料和方法

材料

褐藻于2016年3月采于澳大利亚新南威尔士州的Bateau Bay rocky shore。采集样品后用海水清洗，以去除天然残留物（沙和浅底动物），保存在一个盒子里，避光处理，并立即送往实验室。然后用新鲜的水彻底清洗海藻，浸泡在液氮中，然后用冷冻干燥机（澳大利亚托马斯有限公司）在压力2times;10^minus;1 mbar和温度minus;50°C下将其冷冻干燥48小时。干燥的样品需粉碎，使用0.6毫米英制2000不锈钢网筛(英国Endecotts有限公司) 过筛使粒度le;0.6毫米，在minus;20°C下保存以便进一步分析。

超声波辅助提取（UAE）方法

冷冻干燥后的褐藻用70%乙醇（体积比）、料液比1：50（mL· g^minus;1），在220 V、50 Hz、250 W超声波（澳大利亚Soniclean有限公司）条件下进行萃取。采用响应面法（RSM）（JMP软件，第13版）设计此次用于提取的实验参数。超声提取之后，提取物立即在冰上冷却到室温（RT），使用0.45-mu;m纤维素注射器过滤器（Phenomenex澳大利亚企业）过滤，稀释一定的倍数后进行定量分析。

传统的提取方法

传统的提取方法是根据Hossain等（2012）的方法进行了一些修改。干燥的样品提取条件为70%乙醇、液料比1:50（ml·g^-1）、温度30℃，用摇动式水浴法将样品摇晃12小时。然后得到这些提取物立即在冰上冷却到室温（RT），过滤并稀释到所需的体积进行分析。

响应面法

采用Box-Behnken设计的RSM设计实验条件，确定了超声波温度、时间、功率等三个独立参数对提取物的TPC和抗氧化活性的影响。最佳温度范围（30 - 50°C）、时间（20-60 min）和超声波的力量（60 - 100%或150 - 250 W）测定基于初步实验（数据未显示）。

独立变量及其代码变量的级别如表1所示。为了将TPC值或抗氧化活性作为自变量的函数来表达，使用了二阶多项式方程（Eq.1），由Vuong等人（2014）描述：

Y=beta;₀ beta;_iX_i beta;_ijX_j beta;_ijX_ij² （1）

不同的X_i值是影响响应值Y的独立变量，beta; ₀ , beta; _i , beta; _ii 和 beta; _ij分别为截距、线性、二次和交互项的回归系数，k是变量的个数。三个独立的超声参数被设定为X ₁（温度℃），X ₂（时间min）和X ₃超声功率（%）。

因此，包含这三个独立变量的函数表示如下（Eq. 2）：

Y=beta;₀ beta;₁X₁ beta;₂X₂ beta;₃X₃ beta;₁₂X₁X₂ beta;₁₃X₁X₃ beta;₂₃X₂X₃ beta;₁₁X₁² beta;₂₂X₂² beta;₃₃X₃² （2）

表1 Box-Behnken设计的自变量及其水平

总酚含量的测定

总酚含量（TPC）

将提取液稀释至最佳吸收范围，进行比色评价。TPC是根据Vuong等的方法确定的（2013）。

简单地说，取0.5ml的稀释样品，加入2.5 ml的10%（v / v）福林酚（Folin-Ciocalteu）试剂，随后加入2 ml的Na₂C0₃ 7.5%（w / v），然后在一个旋涡振动器上混合2分钟，在室温（RT）黑暗处下孵化1小时，最后在765 nm波长处测量吸光度。以没食子酸（gallic acid，1 GAE）为参比绘制标准曲线，总酚含量以每克干基质量的GAE当量表示，单位为mg GAE g^-1。

测定抗氧化活性

总抗氧化能力（ABTS）

将提取液稀释，以适应比色评价的最佳吸收范围。测定总抗氧化能力就像Thaipong等所描述的那样（2006）。以甲醇为对照，以6-羟基-2,5,7,8四甲基铬-2-羧酸为标准。标准曲线线性为25到1000 mu;M trolox。结果以每克干物质的TE（trolox equivalents）当量表示，单位为mg TE g ^minus;1 。

DPPH自由基（DPPH）

对提取液进行了稀释分析，分析了1,1-二苯基2-吡咯酰肼（DPPH），正如Brand-Williams 等人（1995）所述。以甲醇和trolox为对照和标准，标准曲线线性为25到1000 mu;M trolox。研究结果以mg TE g^minus;1干物质表示。

铁还原抗氧化能力（FRAP）

用FRAP分析方法对提取液进行了稀释，并对其铁螯合能力进行了分析，如Benzie和Strain (1999)所述。用trolox作为校准标准，标准曲线线性为25到1000 mu;M trolox，研究结果以mg TE g^minus;1干物质表示。

统计分析

使用JMP软件进行RSM实验设计和分析（第13版)）。该软件还应用于建立模型方程，绘制了变量响应的三维和二维等高线图，并预测了三个响应变量的最优值。所有的测量都是一式三份（n= 3）。结果以均值为标准偏差，采用方差分析和LSD后特设检验（P lt; 0.05），检验不同处理间的显著差异。使用Pearson相关系数计算数据之间的相关性，并表示为R²。使用SPSS 16.0统计软件包进行所有数据分析。

结果

拟合的模型

评估TPC值和抗氧化活动的模型是很重要的，RSM的数学模型精确地预测了理想的方差，并确定了所选参数与超声提取的相关性。因此，采用方差分析来评价RSM数学模型的可靠性。从所有实验中得到的萃取物的TPC值和抗氧化活性见表2。方差分析（ANOVA）表明TPC响应的多重确定系数（R²）为0.97，表明TPC模型数据的实际值与预测值之间存在密切的相关性。缺乏拟合值（失拟项）决定了模型的充分性，并无显著性（P gt; 0.05），表明该模型能够充分拟合实验数据（表3）（Wu 等人 2012）。同时，利用P值和t比率来确定二次多项式系数的意义。P值越小，t比率越大，说明对相应变量的影响越大（Kha 等人 2013）。模型的P值为0.002（考虑置信区间

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