pH和金属离子对儿茶素抗氧化活性的影响外文翻译资料

 2022-12-30 11:01:27

pH和金属离子对儿茶素抗氧化活性的影响

原文作者：Midori KUMAMOTO, Tamiyoshi SONDA, Kinuyo NAGAYAMA amp; Masaaki TABATA

摘要：本文通过氧电极法研究了pH 对邻苯二酚、邻苯三酚和四个儿茶素抗氧化活性的影响以及金属离子(Al3 、Ca2 、Cd2 、Co2 、Cr3 、Cu2 、Fe2 、Fe3 、K 、Mg2 、Mn2 、Na 和Zn2 ) 对(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)抗氧化活性的影响。结果表明，儿茶素的抗氧化活性在pH 6-12下高且稳定，但在酸性和强碱性溶液中则降低。上述金属离子中，铜(II)离子能最大程度地提高EGCG的抗氧化活性，而铁(II)离子在很大程度上抑制了EGCG的抗氧化活性。以上研究结果有考虑到儿茶素的金属配合物形成和氧化电位变化等因素。

关键词：抗氧化活性；儿茶素；金属离子；氧化电位

茶叶中的儿茶素具有许多生理功能，特别是抗氧化活性最近由于有效地防止了食物的氧化以及癌症等与生活方式有关的疾病而引起了广泛的关注。此外，现在也有许多关于包括儿茶素和黄酮类化合物在内的酚类化合物的抗氧化活性机制的研究。

Rice-Evans 等人发现黄酮类化合物及其同源物的抗氧化活性与结构之间的关系。他们指出了酚类化合物的重要性。Jovanovic等人根据在pH7和pH10上观察到的反应速率的差异，提出了一种将黄酮类化合物的抗氧化活性归因于其氧化的机制。然而，目前还没有关于 pH和金属离子效应的其他研究，尽管铜、铁、锌、钠和钾等金属离子存在于茶叶和人体中。因为酚类化合物与金属离子反应形成金属配合物，所以这些金属离子可能通过与儿茶素结合而影响儿茶素的抗氧化活性或氧化。

我们以前曾报道过一种简单的氧电极法测定茶溶液和四个儿茶素的抗氧化活性的方法，这使我们能够快速测量儿茶素在不同实验条件下，如不同的pH和不同金属离子的共存条件下的抗氧化活性。

本研究的目的是发现各种pH和金属离子对儿茶素抗氧化活性的影响。我们用这种方法测量了在pH 1～13的一个广泛pH范围内和在13 种金属离子存在下儿茶素的抗氧化活性。此外，我们还测定了茶叶中金属的浓度，并用分光光度法研究了金属离子与儿茶素的平衡。同时我们测定了儿茶素在不同pH下的氧化电位和抗氧化活性，并根据儿茶素的酸解常数、络合物形成和氧化电位对这些结果进行了讨论。

1材料与方法

1.1材料

超高纯度（gt;98%）的(-)-表儿茶素(EC)、(-)-表没食子儿茶素(EGC)、(-)-表儿茶素没食子酸酯(ECG)和(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，这些试剂从库里塔bull;高野有限公司（日本东京）获得的。间苯三酚羧酸是从东京卡塞有限公司（日本东京）获得的。所有使用的金属氯化物试剂均来自瓦科纯化工有限公司（日本大阪）。所有试剂均为分析级，无需进一步纯化即可使用。儿茶素被溶解在弱酸性溶液中，并在厌氧条件下通过氮气净化。这些溶液用棕色瓶子冷冻保存。其他溶液在每次实验前准备好。

EC：R1=R2=H

EGC：R1=OH，R2=H

ECG：R1=H，R2=X

EGCG：R1=OH，R2=X

图1.儿茶素的结构

1.2方法

1.2.1茶液的制备

采用 Ure-shino-cha（日本佐贺）和Yame-cha（日本福冈）的茶叶。用常规超声波仪在室温下将2g茶叶中的儿茶素和金属提取到40ml 50%(v/v)乙腈水溶液中。 提取后的溶液通过亲水膜(0.45um)过滤到100mL容量瓶中，并用纯水填充到标记处。这些溶液用于儿茶素和金属含量的测定和其抗氧化活性的评价。

1.2.2测定抗氧化活性

儿茶素的抗氧化活性如我们以前的论文所描述的，是用生物溶解氧计Oxygraph8（中央卡加库有限公司，东京，日本）来测定的。这种方法是基于通过添加2，2-azobis（2，4-二甲基戊腈）、AMVN 开始的链过氧化反应所消耗的氧的变化来测量的。将含有0.05M亚油酸的溶液（1.2mL）溶解在0.5M SDS（pH7.4）中，放入37℃的反应池中。将10uL的酚类化合物或1*10-3M儿茶素样品溶液（5uL用于茶样液）放入反应池中。此外，将1M的20uL AMVN的甲醇溶液，注入反应池中，样品的最终浓度为8.13*10-6 M，然后测量每个样品的耗氧量随时间的变化。所有操作在暗室中进行。

1.2.3茶溶液中儿茶素和金属的测定

由于茶中涉及的儿茶素和氨基酸干扰了原子吸收法对金属的测量，因此通过焚烧茶溶液来去除它们。将上述制备的50mL茶叶水溶液放入坩埚中，溶剂在热板上蒸发干燥，干燥后的样品在马弗炉中550℃ 下加热10小时制成灰分。在坩埚中加入5mL 20%盐酸，使灰分充分溶解，并在热板上再次加热蒸发。在坩埚的灰分中加入20mL 3%的盐酸溶液，然后过滤，滤液中加入3%盐酸溶液至100ml。

用日立原子吸收分光度计Z5000（日本东京）测定了茶溶液中每种金属(Al、Cd、Co、Cr、Cu、K、Mn和Na) 的含量。用精工SPS1500 VR（日本千叶）进行ICP分析，测定了Ca、Fe、Mn和Zn的浓度。

用高效液相色谱法测定儿茶素的浓度。HPLC系统由Waters-600控制器和泵组成（日本东京）。电化学检测器是Eicom ECD-300（日本京都），它具有不锈钢对电极、Ag/AgCl参比电极和玻碳工作电极。该柱为Capcellpak C18 AG120（4.6x250mm；资生堂有限公司，日本，东京），柱温由U-620 型30控制器（Sugai Chem有限公司，日本，瓦卡山）控制。HPLC分析在以下条件下进行：柱温，40℃；流速，1.0mL min-1；注射体积，10uL；溶剂组成，水：乙腈：乙酸乙酯=85：12：3 %(v/v)，其中水中含有磷酸(0.1M)和EDTA(l.0*10-4M)。

1.2.4光谱测量

用岛津2200A紫外-可见分光光度计（日本京都）测定儿茶素和金属离子溶液在 25℃下的紫外可见吸收光谱，金属离子总浓度为1*10-4 M，EC、EGC、ECG 和EGCG 分别为1*10-4、2*10-4、2*10-5、和5*10-5M，通过添加KC1使离子强度达到0.10。

1.2.5儿茶素酸解离常数的测定

对于每种儿茶素和金属离子，将在固定波长下观察到的吸光度根据pH值作图。通过非线性最小二乘法分析吸光值的变化，并计算相关化学样本的酸解离常数和摩尔消光系数。

1.2.6循环伏安法

用Yanaco极谱分析仪P-1100（日本京都）对儿茶素进行循环伏安测定。电极是铂作为对电极，Ag/AgCl（211mV对NHE）作为参比电极，玻碳作为工作电极。扫频率为10mV s-1，以硫酸钠为电解质溶液(0.1M)。缓冲液和样品溶液的浓度分别为1*10-2和2*10-3 M，所有测量均在室温(25°C)进行。

2结果与讨论

2.1各种酚类化合物的抗氧化活性

抗氧化活性用抗氧化剂存在时（Rrsquo;p）和不存在时（Rp）的亚油酸氧化速率之比表示。其值（Rrsquo;p/Rp）越低，其抗氧化活性越高。表1概述了在pH7.4酚类化合物和儿茶素的抗氧化活性（Rrsquo;p/Rp）。

表1. 酚类化合物和儿茶素的抗氧化活性

数值Rrsquo;p/Rp 代表抗氧化活性。Rp和Rrsquo;p分别是指在有和没有酚类化合物和儿茶素(8.13*10-6 M)的情况下亚油酸的氧化速率。

抗氧化活性取决于羟基相对于双酚A 的位置(o-，m-，p-)：邻苯二酚（0.618）gt; 对苯二酚（0.763）gt; 间苯二酚（0.961）。对于具有三个羟基的化合物，其抗氧化活性依次为邻苯三酚（0.545）gt; 羟基氢醌（0.752）gt; 间苯三酚（0.991）。具有相邻羟基的化合物具有较高的抗氧化活性，另一方面，具有羧基而不是羟基的酚类化合物表现出较小的抗氧化活性。

茶液中儿茶素的含量总结在表2中，其溶液的抗氧化活性值分别为Ureshino 的0.406和 Yame-cha的0.397。茶叶溶液具有相当于或高于EGCG的抗氧化活性。

表2.茶叶中的儿茶素

从2克均质茶叶中提取儿茶素，制成40mL50%(v/v)乙腈的水溶液，用水定容至100 mL。估计值以每克茶叶的数量（mg）表示。

2.2 pH 对儿茶素抗氧化活性的影响

测定了4种儿茶素在不同pH下的抗氧化活性，结果如图2所示。儿茶素在pH1-5处表现出较少的抗氧化活性，而在pH6-12处表现出较高的活性。而在pH 高于13时，活性降低，这种趋势类似于邻苯二酚或邻苯三酚。儿茶素的抗氧化活性在pH6-12处按EGCG gt; ECG = EGC gt;gt; EC的顺序降低，这个顺序取决于化合物的羟基数。

图2. pH 对儿茶素抗氧化活性（Rrsquo;p/Rp）的影响

儿茶素的总浓度为8.13*10-6M。抗氧化剂活性（Rrsquo;p / Rp）由在不存在抗氧化剂（Rp）和存在（Rrsquo;p）的情况下亚油酸的氧化速率之比表示。

不同pH下抗氧化活性的变化预计与抗氧化剂的酸解离常数（pKa）有关。酸解离常数与其他参考值汇总在表3中。较小的pKa1的儿茶素表现出较高的抗氧化活性（表1）。然而，儿茶素在pH低于Pka1值时开始显示出抗氧化活性值（图2），其中所有四个儿茶素都是完全质子化的。控制抗氧化活性的另一个因素是形成稳定的苯氧基和半喹啉自由基，这些自由基很容易与脂质自由基发生反应。在20°C下，对于EC、EGC、ECG和EGCG，通过脉冲辐射分解测得的苯氧基自由基的酸解离常数分别为4.6、5.5、4.3和4.4或5.5。因此，这些儿茶素可以发挥在pH高于5时的抗氧化活性，由于儿茶素酸的形成，pHgt;12 时抗氧化活性较低。

表3.儿茶素酸解常数

2.3金属离子对EGCG 抗氧化活性的影响

在13种金属离子存在下，考察了EGCG的抗氧化活性，结果如图3所示。Rrsquo;p和 Rrsquo;rsquo;p代表在EGCG（8.13*10-6M）、EGCG（8.06*10-6M）、金属离子（8.06*10-6M）存在下亚油酸的氧化速率，高值100 Rrsquo;p/Rrsquo;rsquo;p（%）对应于金属离子对EGCG 抗氧化活性的增加。Cu2 和Mn2 提高EGCG的抗氧化活性，而Fe2 抑制其抗氧化活性。有趣的是，Cu2 显著提高EGCG 的抗氧化活性。一般情况下，Cu2 、Fe2 和Fe3 已经被认为是一种自由基发生器。然而，Roedig-Penman等人在Fe3 或Cu2 存在下，在油包水乳中检测了ECG和EGCG的抗氧化活性，发现Fe3 能提高油的氧化，同时Cu2 对油氧化几乎没有什么影响。为了阐明金属离子对EGCG 抗氧化活性的模糊影响，我们研究了金属络合物在儿茶素与金属离子之间形成的平衡，并测量了金属离子存在下儿茶素的氧化电位。

图3. 金属离子对EGCG抗氧化活性（100 Rrsquo;p/Rrsquo;rsquo;p（%））的影响

EGCG 和金属离子的总浓度为8.06*10-6M。Rrsquo;p和Rrsquo;rsquo;p代表亚油酸在EGCG 存在和EGCG 和金属离子存在下的氧化速率。100 Rrsquo;p/Rrsquo;rsquo;p（%）表示金属离子对EGCG抗氧化活性的影响。

2.4儿茶素与金属离子的络合作用

关于金属与酚类化合物的络合作用有许多研究，如酚类化合物、多酚、儿茶酚、邻苯三酚、没食子酸、没食子酸酯、黄酮类化合物还有茶黄素。Weber报道说，黄酮类化合物与Cu2 和Fe3结合基于HPLC 组分的循环伏安法和

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