发根农杆菌菌株及其他参数对candollei葛根毛状根中异黄酮类物质产量的影响外文翻译资料

发根农杆菌菌株及其他参数对candollei葛根毛状根中异黄酮类物质产量的影响

原文作者：Pimsiri Danphitsanuparn bull; Panitch Boonsnongcheep bull; Thanaphol Boriboonkaset bull; Yupyn Chintapakorn bull; Sompop Prathanturarug

摘要：利用两种发根农杆菌菌株（ ATCC 15834 和 43057）侵染几株candollei葛根的外植体，培养出毛状根，在含有 100 mu;M 乙酰丁香酮的培养基中，毛状根的诱导频率最多可提高58％。随后，确定接种量（IS）和温度对毛状根中异黄酮的生长和产生的影响。1％接种量和 32°C 的条件使毛状根中总异黄酮含量积累最高，最高为 31.0plusmn;22.6 mg / g干重（DW）。再者，在 32°C 的条件下培养毛状根可减少毛状根褐变。此外，该温度促进了次级代谢产物黄豆苷元的积累。然而，在固定阶段毛状根培养物中积累的异黄酮葛根素含量高于黄豆苷元。

关键词：乙酰丁香酮；发根农杆菌；植物生物技术；葛根素；次生代谢产物

缩略语

AS 乙酰丁香酮

B5 Gamborg 的 B5 培养基（Gamborg 等，1968）

DW 净重

FW 鲜重

IS 接种量

MS MS培养基(Murashige 和 Skoog ，1962)

引言

candollei葛根（豆科）因其具有使人恢复活力的特性而被用于泰国传统医学中。这种植物在泰国有两个品种,P.candollei Grah.ex Benth.var.candollei和 P.candollei Grah.ex Benth.var.mirifica Niyomdham（Keung 2002）。现已在坎多莱葛根的块根中发现大量的植物雌激素,包括异黄酮类（例如染料木黄酮和黄豆苷元），异黄酮类苷（例如染料木黄酮，黄豆苷元和葛根素），苯并吡喃，香豆素和紫檀素（Ingham 等1986; Chansakaow 等2000a，b）。此外，这两个品种的化合物类型非常相似（Boonsnongcheep 等，2010；Yusakul 等，2011）。

据几项研究报道，candollei葛根具有雌激素活性（Chansakaow 等，2000a，b；Trisomboon 等，2006），预防骨质流失（Urasopon 等，2007）和抗氧化特性（Cherdshewasart和Sutjit，2008；Sucontphunt 等，2011）。

目前，这种植物是从自然资源中收集的，存在一些固有的问题，例如块根的数量不稳定，异黄酮含量不定（取决于年龄和环境）（Cherdshewasart 和Sriwatcharakul 2007）以及因其他物种的误认造成的污染。

毛状根培养物几十年来已经被用于生产一些群体的次生代谢物，因为它具有许多优势，例如在无激素培养基中快速生长，高遗传稳定性和高水平的次生代谢产物的产生（Sevoacute;n 和 OksmanCaldentey 2002；Georgiev 等，2007）。而且，毛状根是一种器官培养；因此，其产生次生代谢产物的能力要高于完整植物（Dehghan 等人，2012），细胞悬浮液和愈伤组织培养物（Chandra 和 Chandra 2011）。

毛状根诱导过程与几种因素有关。本研究侧重于发根农杆菌菌株，外植体的年龄，外植体部分以及乙酰丁香酮的浓度。发根农杆菌的菌株和外植体部分影响毛状根的诱导频率，该频率对植物物种具有特异性（Pietrosiuk 等，2006；Sidwa-Gorycka 等，2009；Thimmaraju 等，2008）。大多数成功的研究报告显示，发根农杆菌农杆菌菌株（ATCC 43057，ATCC 15834，LBA 9402 和NCPPB 1855）对毛状根诱导频率高（Sevoacute;n 和 Oksman-Caldentey 2002 ；Shi 等，2011）。在侵染过程中，由损伤细胞分泌的酚类化合物乙酰丁香酮能影响农杆菌T-DNA转导的刺激。（Sheikholeslam 和 Weeks 1987 ；Stachel 等，1985）。因此，在培养基中添加乙酰丁香酮可以增强毛状根的诱导（Saleh 和 Thuc 2009；Tao 和 Li 2006；Wang 等，2001）。

据报道，葛根毛状根的培养条件和诱导技术对其生长和异黄酮生成有影响（Kintzios 等，2004；Liu 等，2002；Shi 和 Kintzios，2003；Udomsuk 等，2009，2011）。然而，为了最大化发挥毛状根在工业水平的作用，必须评估培养参数。因此，本研究旨在优化诱导毛根的条件，并研究接种量和温度对candollei葛根的毛状根生长和异黄酮生成的影响。

材料与方法

植物原料

candollei葛根的种子是从泰国北碧府收集的，标本样品存放在 Mahidol 大学标本室中（PBM）（收藏编号：Prathanturrug 00113）。将种子浸入真菌溶液（1g/l）中45分钟，用70％乙醇洗涤10分钟，使用含有Tween 80reg;（1滴/100ml溶液）的5％次氯酸钠溶液进行表面消毒 45 分钟，并用无菌蒸馏水洗涤3次。种子在 25°C ，16/8 h的明/暗条件下，在半固态MS（Murashige and Skoog 1962）培养基上发芽。

毛状根培养的建立和转化的确认

将七日龄candollei葛根幼苗的叶片，子叶，上胚轴和下胚轴浸入在酵母甘露醇肉汤中的发根农杆菌（ATCC 15834 和 43057）悬浮液中。将被侵染的外植体置于添加100和200lmu;M乙酰丁香酮的半固体MS培养基上培养7天，然后转移并在半固体 MS 培养基上培养，直到出现毛状根为止。通过在补充有头孢噻肟和氨苄青霉素（分别为250 mg / l）的 Gamborg（B5）（Gamborg 等人 1968）培养基中培养毛状根来消除发根农杆菌，直到获得无菌的毛状根。

使用DNeasy植物迷你试剂盒（德国奇根）从无菌的毛状根中提取DNA。使用这些引物扩增：rolB 和 rolC。rolB1：5rsquo;-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3rsquo;，rolB2：5rsquo;-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3，rolC1：5rsquo;-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3rsquo;和rolC2：5rsquo;-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3rsquo;（Furner 等，1986 ；Shi 和Kintzios，2003）。聚合酶链反应（PCR）在以下条件下进行：95°C持续2分钟；30个循环，95°C持续30秒，53.5°C持续45秒，72°C持续45秒；最后一步，72°C持续6分钟。用溴化乙锭染色后，在260nm紫外光下，在1%（w/v）琼脂糖凝胶上电泳检测PCR产物。

接种量和温度的影响

在25和32°C的50 ml液态B5培养基中培养1%和2%（w/v）的毛状根，在摇床上以110 rpm 的转速培养30天。每5天采集一次毛状根，直到第30天，并测量鲜重（F W）；然后将样品在60°C下干燥72h，测定干重（D W）。此外，记录褐变的百分比（0=无褐变或褐变lt;50%，1=褐变≧50%）。每种处理重复三次。生长指数由干重计算，采用以下方程：生长指数=（最终D W-初始D W）/初始D W（Korsangruang等，2010）.

异黄酮的提取与分析

用研钵和研杵研磨干燥的毛状根，并将细粉在 40°C 的超声波浴中用 30 ml 的甲醇（AR级）萃取。将每个样品萃取3次，然后使用旋转蒸发仪干燥合并萃取物。在10毫升容量瓶用甲醇（HPLC 级）调节干燥提取液的体积（0.01 g），然后通过0.45mu;m注射过滤器过滤，然后进行分析。采用岛津HPLC型LC-10ADVP分析工作站连接SPD-M10AVP-光电二极管阵列探测器，配备一个PurospherRP-18柱（250mm93.2mm I.d.，5lm孔径）。高效液相色谱法（H PLC）的条件遵循Boonsnongcheep等人的条件（2010）。

统计分析

数据来自三个重复plusmn;SE的平均值。采用单向方差分析（SPSS Statistics17.0程序）对数据进行分析，然后采用Duncan的多重范围检验。（p=0.05）

结果和讨论

毛状根培养的建立和转化的确认

在我们的初步研究中，以离体成熟植物和不同年龄的离体幼苗（7、14和21天龄）的叶片作为初始外植体，建立毛状根培养。结果表明，毛状根不能通过培养成熟叶片和7天以上的外植体产生（数据未显示）。因此，在诱导步骤中，采用7天龄幼苗与补充有AS的MS培养基上的发根农杆菌共培养。

叶片和上胚轴（发根农杆菌ATCC 43057侵染）与子叶（发根农杆菌 ATCC 15834侵染）在补充有 100mu;M AS 的半固体 MS 培养基上共培养后，毛状根诱导的反应明显高于其他处理（p = 0.05）。（表1）。以往研究表明，发根农杆菌菌株除了影响植株外，还影响了毛状根的诱导（Pietrosiuk 等，2006；Thimmaraju ，2008）。如本研究中所观察到的，当与农杆菌型菌株共培养时（Shi和Kintzios，2003年；Udomsuk等，2009）毛状根可在葛根的幼外植体中诱导。

适当的 AS 浓度可促进毛状根的诱导（Geng 等，2012）随着100lmu;M AS的补充，毛状根诱导的百分比增加。在叶片感染后用 ATCC 43057 在含有 100mu;MAS 的 MS 上培养，毛状根诱导频率最高为58.33%。相反，我们发现200mu;M AS 抑制了毛状根的诱导（表 1）。AS 是众所周知的参与农杆菌 T-DNA 转导的酚类化合物（Sheikholeslam and Weeks 1987）。

表 1 candollei葛根外植体的毛状根诱导百分比

发根农杆菌菌株 AS（mu;M） 外植体 诱导％a

ATCC 15834 100 叶 16.67 bc

子叶 50.00 a

上胚轴 41.67 a b

下胚轴 16.67 bc

200 叶 0 c

子叶 0 c

上胚轴 0 c

下胚轴 0 c

ATCC 43057 100 叶 58.33 a

子叶 8.33 c

上胚轴 50.00 a

下胚轴 8.33 c

200 叶 0c

子叶 0 c

上胚轴 16.67 bc

下胚轴 0 c

控制 叶 0 c

子叶 16.67 bc

上胚轴 0 c

下胚轴 0 c

根据 Duncan 的多范围测试，在 p = 0.05 时，诱导a％后跟不同字母的诱导显著不同(Stachel 等，1985）。多项研究支持以下观察结果：在毛状根诱导步骤中，存在 AS 的培养基毛状根诱导的频率高于不存在 AS 的频率（Geng等，2012，Tao和Li 2006；Saleh and Thuc 2009;Wang等，2001）。但是，在我们的研究中，200mu;M的浓度可能对细胞活力产生了负面影响，并降低了毛状根的诱导。因此，必须优化AS的浓度。

选择从上胚轴（用 ATCC 43057 侵染）获得的毛状根来研究接种量和温度的影响，因为该系显示出独特的毛状根特征，包括高侧枝形成和快速生长（图 1）。此外，在该毛状根系中检测到 rolB 和 rolC（图 2），证实了转化（Dehghan等，2012； Mathur等，2010;Shi and Kintzios2003).

接种量和温度的影响

在所有处理下（1％接种量 25°C，1％接种量 32°C，2％接种量 25°C和 2％接种量 32°C），毛状根培养物均显示出相同的生长模式，其中包括滞后期，指数期和稳定期。毛状根从培养的第 5 天开始生长，并在培养期的第 20 天达到静止期。最大 DW高达 646.2plusmn;2.9 mg /瓶。

图1 由发根农杆菌 ATCC 侵染的candollei葛根的上胚轴形成毛状根。

a:半固体B5培养基上的初生毛根；

b:在液体B5培养基中培养30天后的无菌毛状根。

图2 聚合酶链反应（PCR）分析1％琼脂糖凝胶上的 rolB 和rolC：

a和h为DNA标记；

b为从毛状根的 DNA 中扩增出的rolB 条带；

c为发根农杆菌 DNA的rolB的扩增条带（阳性对照）；

d 和g为蒸馏水（阴性对照）；

e为从毛状根DNA中扩增出的rolc带；

f为发根农杆菌DNA中rolC的扩增带（阳性对照）

在第30天使用2％接种量并在25°C下培养，但是在任何处理下，生物量的产生均没有差异（p = 0.05）（图 3）。在所有处理下，养分，氧气含量和培养瓶体积的限制可能是限制生物量原因（Jeong 等，2002）。但是，在这两个温度下，在1％接种量下的生长指数都显着高于在2％接种量下的生长指数，在第 20 天和第 25 天时大约增长了两倍（p = 0.05）。此外，在1％接种量下最大生长指数出现在第 20 天

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