发根农杆菌菌株及其他参数对candollei葛根毛状根中异黄酮类物质产量的影响外文翻译资料

 2022-12-30 11:01:17

发根农杆菌菌株及其他参数对candollei葛根毛状根中异黄酮类物质产量的影响

原文作者:Pimsiri Danphitsanuparn bull; Panitch Boonsnongcheep bull; Thanaphol Boriboonkaset bull; Yupyn Chintapakorn bull; Sompop Prathanturarug

摘要:利用两种发根农杆菌菌株( ATCC 15834 和 43057)侵染几株candollei葛根的外植体,培养出毛状根,在含有 100 mu;M 乙酰丁香酮的培养基中,毛状根的诱导频率最多可提高58%。随后,确定接种量(IS)和温度对毛状根中异黄酮的生长和产生的影响。1%接种量和 32°C 的条件使毛状根中总异黄酮含量积累最高,最高为 31.0plusmn;22.6 mg / g干重(DW)。再者,在 32°C 的条件下培养毛状根可减少毛状根褐变。此外,该温度促进了次级代谢产物黄豆苷元的积累。然而,在固定阶段毛状根培养物中积累的异黄酮葛根素含量高于黄豆苷元。

关键词:乙酰丁香酮;发根农杆菌;植物生物技术;葛根素;次生代谢产物

缩略语

AS 乙酰丁香酮

B5 Gamborg 的 B5 培养基(Gamborg 等,1968)

DW 净重

FW 鲜重

IS 接种量

MS MS培养基(Murashige 和 Skoog ,1962)

引言

candollei葛根(豆科)因其具有使人恢复活力的特性而被用于泰国传统医学中。这种植物在泰国有两个品种,P.candollei Grah.ex Benth.var.candollei和 P.candollei Grah.ex Benth.var.mirifica Niyomdham(Keung 2002)。现已在坎多莱葛根的块根中发现大量的植物雌激素,包括异黄酮类(例如染料木黄酮和黄豆苷元),异黄酮类苷(例如染料木黄酮,黄豆苷元和葛根素),苯并吡喃,香豆素和紫檀素(Ingham 等1986; Chansakaow 等2000a,b)。此外,这两个品种的化合物类型非常相似(Boonsnongcheep 等,2010;Yusakul 等,2011)。

据几项研究报道,candollei葛根具有雌激素活性(Chansakaow 等,2000a,b;Trisomboon 等,2006),预防骨质流失(Urasopon 等,2007)和抗氧化特性(Cherdshewasart和Sutjit,2008;Sucontphunt 等,2011)。

目前,这种植物是从自然资源中收集的,存在一些固有的问题,例如块根的数量不稳定,异黄酮含量不定(取决于年龄和环境)(Cherdshewasart 和Sriwatcharakul 2007)以及因其他物种的误认造成的污染。

毛状根培养物几十年来已经被用于生产一些群体的次生代谢物,因为它具有许多优势,例如在无激素培养基中快速生长,高遗传稳定性和高水平的次生代谢产物的产生(Sevoacute;n 和 OksmanCaldentey 2002;Georgiev 等,2007)。而且,毛状根是一种器官培养;因此,其产生次生代谢产物的能力要高于完整植物(Dehghan 等人,2012),细胞悬浮液和愈伤组织培养物(Chandra 和 Chandra 2011)。

毛状根诱导过程与几种因素有关。本研究侧重于发根农杆菌菌株,外植体的年龄,外植体部分以及乙酰丁香酮的浓度。发根农杆菌的菌株和外植体部分影响毛状根的诱导频率,该频率对植物物种具有特异性(Pietrosiuk 等,2006;Sidwa-Gorycka 等,2009;Thimmaraju 等,2008)。大多数成功的研究报告显示,发根农杆菌农杆菌菌株(ATCC 43057,ATCC 15834,LBA 9402 和NCPPB 1855)对毛状根诱导频率高(Sevoacute;n 和 Oksman-Caldentey 2002 ;Shi 等,2011)。在侵染过程中,由损伤细胞分泌的酚类化合物乙酰丁香酮能影响农杆菌T-DNA转导的刺激。(Sheikholeslam 和 Weeks 1987 ;Stachel 等,1985)。因此,在培养基中添加乙酰丁香酮可以增强毛状根的诱导(Saleh 和 Thuc 2009;Tao 和 Li 2006;Wang 等,2001)。

据报道,葛根毛状根的培养条件和诱导技术对其生长和异黄酮生成有影响(Kintzios 等,2004;Liu 等,2002;Shi 和 Kintzios,2003;Udomsuk 等,2009,2011)。然而,为了最大化发挥毛状根在工业水平的作用,必须评估培养参数。因此,本研究旨在优化诱导毛根的条件,并研究接种量和温度对candollei葛根的毛状根生长和异黄酮生成的影响。

材料与方法

植物原料

candollei葛根的种子是从泰国北碧府收集的,标本样品存放在 Mahidol 大学标本室中(PBM)(收藏编号:Prathanturrug 00113)。将种子浸入真菌溶液(1g/l)中45分钟,用70%乙醇洗涤10分钟,使用含有Tween 80reg;(1滴/100ml溶液)的5%次氯酸钠溶液进行表面消毒 45 分钟,并用无菌蒸馏水洗涤3次。种子在 25°C ,16/8 h的明/暗条件下,在半固态MS(Murashige and Skoog 1962)培养基上发芽。

毛状根培养的建立和转化的确认

将七日龄candollei葛根幼苗的叶片,子叶,上胚轴和下胚轴浸入在酵母甘露醇肉汤中的发根农杆菌(ATCC 15834 和 43057)悬浮液中。将被侵染的外植体置于添加100和200lmu;M乙酰丁香酮的半固体MS培养基上培养7天,然后转移并在半固体 MS 培养基上培养,直到出现毛状根为止。通过在补充有头孢噻肟和氨苄青霉素(分别为250 mg / l)的 Gamborg(B5)(Gamborg 等人 1968)培养基中培养毛状根来消除发根农杆菌,直到获得无菌的毛状根。

使用DNeasy植物迷你试剂盒(德国奇根)从无菌的毛状根中提取DNA。使用这些引物扩增:rolB 和 rolC。rolB1:5rsquo;-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3rsquo;,rolB2:5rsquo;-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3,rolC1:5rsquo;-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3rsquo;和rolC2:5rsquo;-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3rsquo;(Furner 等,1986 ;Shi 和Kintzios,2003)。聚合酶链反应(PCR)在以下条件下进行:95°C持续2分钟;30个循环,95°C持续30秒,53.5°C持续45秒,72°C持续45秒;最后一步,72°C持续6分钟。用溴化乙锭染色后,在260nm紫外光下,在1%(w/v)琼脂糖凝胶上电泳检测PCR产物。

接种量和温度的影响

在25和32°C的50 ml液态B5培养基中培养1%和2%(w/v)的毛状根,在摇床上以110 rpm 的转速培养30天。每5天采集一次毛状根,直到第30天,并测量鲜重(F W);然后将样品在60°C下干燥72h,测定干重(D W)。此外,记录褐变的百分比(0=无褐变或褐变lt;50%,1=褐变≧50%)。每种处理重复三次。生长指数由干重计算,采用以下方程:生长指数=(最终D W-初始D W)/初始D W(Korsangruang等,2010).

异黄酮的提取与分析

用研钵和研杵研磨干燥的毛状根,并将细粉在 40°C 的超声波浴中用 30 ml 的甲醇(AR级)萃取。将每个样品萃取3次,然后使用旋转蒸发仪干燥合并萃取物。在10毫升容量瓶用甲醇(HPLC 级)调节干燥提取液的体积(0.01 g),然后通过0.45mu;m注射过滤器过滤,然后进行分析。采用岛津HPLC型LC-10ADVP分析工作站连接SPD-M10AVP-光电二极管阵列探测器,配备一个PurospherRP-18柱(250mm93.2mm I.d.,5lm孔径)。高效液相色谱法(H PLC)的条件遵循Boonsnongcheep等人的条件(2010)。

统计分析

数据来自三个重复plusmn;SE的平均值。采用单向方差分析(SPSS Statistics17.0程序)对数据进行分析,然后采用Duncan的多重范围检验。(p=0.05)

结果和讨论

毛状根培养的建立和转化的确认

在我们的初步研究中,以离体成熟植物和不同年龄的离体幼苗(7、14和21天龄)的叶片作为初始外植体,建立毛状根培养。结果表明,毛状根不能通过培养成熟叶片和7天以上的外植体产生(数据未显示)。因此,在诱导步骤中,采用7天龄幼苗与补充有AS的MS培养基上的发根农杆菌共培养。

叶片和上胚轴(发根农杆菌ATCC 43057侵染)与子叶(发根农杆菌 ATCC 15834侵染)在补充有 100mu;M AS 的半固体 MS 培养基上共培养后,毛状根诱导的反应明显高于其他处理(p = 0.05)。(表1)。以往研究表明,发根农杆菌菌株除了影响植株外,还影响了毛状根的诱导(Pietrosiuk 等,2006;Thimmaraju ,2008)。如本研究中所观察到的,当与农杆菌型菌株共培养时(Shi和Kintzios,2003年;Udomsuk等,2009)毛状根可在葛根的幼外植体中诱导。

适当的 AS 浓度可促进毛状根的诱导(Geng 等,2012)随着100lmu;M AS的补充,毛状根诱导的百分比增加。在叶片感染后用 ATCC 43057 在含有 100mu;MAS 的 MS 上培养,毛状根诱导频率最高为58.33%。相反,我们发现200mu;M AS 抑制了毛状根的诱导(表 1)。AS 是众所周知的参与农杆菌 T-DNA 转导的酚类化合物(Sheikholeslam and Weeks 1987)。

表 1 candollei葛根外植体的毛状根诱导百分比

发根农杆菌菌株 AS(mu;M) 外植体 诱导%a

ATCC 15834 100 叶 16.67 bc

子叶 50.00 a

上胚轴 41.67 a b

下胚轴 16.67 bc

200 叶 0 c

子叶 0 c

上胚轴 0 c

下胚轴 0 c

ATCC 43057 100 叶 58.33 a

子叶 8.33 c

上胚轴 50.00 a

下胚轴 8.33 c

200 叶 0c

子叶 0 c

上胚轴 16.67 bc

下胚轴 0 c

控制 叶 0 c

子叶 16.67 bc

上胚轴 0 c

下胚轴 0 c

根据 Duncan 的多范围测试,在 p = 0.05 时,诱导a%后跟不同字母的诱导显著不同(Stachel 等,1985)。多项研究支持以下观察结果:在毛状根诱导步骤中,存在 AS 的培养基毛状根诱导的频率高于不存在 AS 的频率(Geng等,2012,Tao和Li 2006;Saleh and Thuc 2009;Wang等,2001)。但是,在我们的研究中,200mu;M的浓度可能对细胞活力产生了负面影响,并降低了毛状根的诱导。因此,必须优化AS的浓度。

选择从上胚轴(用 ATCC 43057 侵染)获得的毛状根来研究接种量和温度的影响,因为该系显示出独特的毛状根特征,包括高侧枝形成和快速生长(图 1)。此外,在该毛状根系中检测到 rolB 和 rolC(图 2),证实了转化(Dehghan等,2012; Mathur等,2010;Shi and Kintzios2003).

接种量和温度的影响

在所有处理下(1%接种量 25°C,1%接种量 32°C,2%接种量 25°C和 2%接种量 32°C),毛状根培养物均显示出相同的生长模式,其中包括滞后期,指数期和稳定期。毛状根从培养的第 5 天开始生长,并在培养期的第 20 天达到静止期。最大 DW高达 646.2plusmn;2.9 mg /瓶。

图1 由发根农杆菌 ATCC 侵染的candollei葛根的上胚轴形成毛状根。

a:半固体B5培养基上的初生毛根;

b:在液体B5培养基中培养30天后的无菌毛状根。

图2 聚合酶链反应(PCR)分析1%琼脂糖凝胶上的 rolB 和rolC:

a和h为DNA标记;

b为从毛状根的 DNA 中扩增出的rolB 条带;

c为发根农杆菌 DNA的rolB的扩增条带(阳性对照);

d 和g为蒸馏水(阴性对照);

e为从毛状根DNA中扩增出的rolc带;

f为发根农杆菌DNA中rolC的扩增带(阳性对照)

在第30天使用2%接种量并在25°C下培养,但是在任何处理下,生物量的产生均没有差异(p = 0.05)(图 3)。在所有处理下,养分,氧气含量和培养瓶体积的限制可能是限制生物量原因(Jeong 等,2002)。但是,在这两个温度下,在1%接种量下的生长指数都显着高于在2%接种量下的生长指数,在第 20 天和第 25 天时大约增长了两倍(p = 0.05)。此外,在1%接种量下最大生长指数出现在第 20 天

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