冬青属的系统发育和生物地理学研究

原文作者：Xin Yao，Yu Song 等

单位：中国科学院西双版纳热带植物园综合保护中心

外文文献出处： J. Syst. Evol. 59(1): 73–82, 2021

摘要：冬青属(Ilex L.)，是木本植物中最大的雌雄异株属(gt;664种)，在中生代环境中近乎世界性分布。我们研究了分布在地理范围内的177个物种，根据两个核基因构建了一个系统发育树，并使用大型化石记录的方法对它们进行了年代测定。我们发现，177个物种中的五个主要分支在始新世早期有一个共同的祖先，比之前相关研究提出的要早得多。冬青属起源于亚洲的亚热带，现存的支系主要发展于南美洲30 Ma，北美23 Ma，澳大利亚8 Ma，欧洲6 Ma，非洲4 Ma。其支系也曾多次被发现发展于南美洲和北美洲，还到达了夏威夷(10 Ma)和其他海洋岛屿。宏观化石和花粉研究表明，该属在时间和空间上和中古气候有密切联系，在晚中新世全球变冷之前，它的分布范围更广。我们的相关进化史研究为比较生态学和进化论的研究提供了一个框架。

关键词： 水生生物门；生物地理；世界性分布；雌雄异株；远距离扩散

简介

进化生物学中存在一个关键问题，为什么一些分支能够广泛传播并产生了许多新物种，而另一些分支却没有。许多被子植物分支，能成功的产生在新的环境中定居或专门化的亚分支而扩展到全球（Hawkins等人，2011年）。然而，冬青属(Ilex L.)仍然由于局限于其可能起源的中生代生长条件，在全年土壤没有水分或冬季寒冷时间较长的地区消失。它有着非常统一的繁殖生物学特征，尽管叶子的形态多种多样，生长形式从匍匐的灌木到高大的乔木都有，但是通过花或果实就可以立即辨认出来。在有利的条件下，该属可以成为植物群落的主要组成部分，在一些亚热带森林群落中能超过10种。然而，该属的区域多样性变化很大，在中国西南部和南美洲各有200种以上的物种，而在欧洲大部分地区、撒哈拉以南的非洲和澳大利亚北部物种就很单一。冬青属也到达了夏威夷和其他海洋岛屿，反映了鸟类能被大量小果实吸引而有效地传播种子，以及一些非特殊的授粉方式(曾和科利特，2005年)。对包括新西兰、澳大利亚东南部和北美西部在内的几个气候温和、缺乏本土冬青物种的偏远地区来说，水叶冬青是一种入侵物种。

冬青树种能以各种方式被利用，其中一些被大规模利用。冬青树种多样化的植物化学成分导致不同物种在经济上有着不同的用途，在南美洲、北美和东亚，冬青可用于制造饮料；也有一些冬青具有药用用途，比如在中国至少有27种冬青树种有药用用途(Yi等人，2016年)。yerba mate 茶（I. paraguariensis）是阿根廷、巴拉圭、乌拉圭和巴西的十亿美元产业。一些较大的树种在当地可用作木材，另一些可做受欢迎的花园观赏植物，通常不同的品种具有不同的用途，有些用于蜂蜜生产，有些常绿树种的叶子和果实可被当作圣诞装饰品，而有些落叶树种在冬天可以为砍下的树枝提供鲜艳的红色果实。冬青属共有150种物种被列入全球IUCN红色名录，其中两种被认为已经灭绝，68种受到威胁；在中国受到评估的171种物种中，有26种被认为受到威胁。一些尚未正式被评估的物种是从单个种群或单个集合中获知的。

先前有研究基于108个物种的系统发育研究，发现了质体和核树之间存在广泛的不一致，并表明东亚或北美的冠枝起源于中新世中期（Manen 等，2010）。但这个年轻的年代很难与宏观化石记录相吻合，因为自始新世以来就具有现代外观的叶子化石，而自白垩纪以来就广泛存在类似 llex 的花粉（参见下面的“用大型化石校准发散时间”）。姐妹谱系的灭绝可以解释这一点，但冠枝的更早起源将是一个更简单的解释。为了提高我们对该属进化的理解，我们采样了许多其他物种，特别是来自最可能的起源地区东亚的物种，并基于两个核基因构建了一个新的系统发育树，并使用三个大型化石记录进行了校准。

材料与方法

2.1 分子测序和系统发育分析

总共鉴定出 177 个冬青属物种和 3 个青荚叶属物种 （H. chinensis Batalin, H. himalaica Hook.f. amp; Thomsonex C. B. Clarke, and H. japonica（Thunb.）F. Dietr.） 作为外群被纳入本研究（表S₁）。177个冬青属物种， 127 个物种来自亚洲（包括澳大利亚北部、新几内亚、博宁群岛和密克罗尼西亚）， 23 个物种来自北美（包括中美洲和加勒比海）， 19 个物种来自南美， 3 个物种来自欧洲（包括地中海地区），2个物种来自加那利-亚速尔群岛的，2个物种来自大洋洲（包括密克罗尼西亚、夏威夷和新喀里多尼亚），1个来自非洲。我们的覆盖面很好，除了南美洲，它是该属的两个多样性中心之一，我们的样本只包括了大约10%的已知物种。

因为冬青中存在细胞核不一致性的问题（Manen等人，2010年），我们选择了两个核标记，即内转录间隔区（ITS）和叶绿体谷氨酰胺合成酶基因（NepGS）。这两个标记的所有可用数据都是从GenBank下载，并包含在我们的分析中。另外81个物种（主要来自中国）作为本研究的一部分进行了测序，还有两个物种进行了一半测序。凭证信息和GenBank登录号见表S₁。

我们根据改进的 CTAB 方法（Doyle amp; Doyle, 1987），从用硅胶干燥的叶子中提取总 DNA。ITS扩增的引物是ITSF (GTAGGTGAACCTGCGGAAGG)和ITSR (TCCTCCGCTTATTGATATGC) (Gu,2011)，nepGS 扩增的引物是GScp687f (GATGCTCACTACAAGGCTTG) 和GScp994r (AATGTGCTCTTTGTGGCGAAG) (Emshwiller amp; Doyle, 1999) 。每次扩增在 50 mu;L 反应混合物中进行，该反应混合物包含 30 mu;L 2times; PCR Master Mixture（包含 2times; Taq DNA 聚合酶、2times; 聚合酶链式反应缓冲液、2times; dNTP 和 Mg ² ）、14 mu;L ddH ₂O、每个引物 0、1 mu;L 和 4 mu;L DNA 模板。扩增在 95 ℃ 下进行 4分钟，95 ℃ 45秒，58 ℃ 1分钟和 72 ℃2 分钟的 35 个循环，然后在 72 ℃ 下进行最终延伸步骤 10 分钟。扩增产物在中国昆明野生物种种质库的 ABI 3730 测序仪（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）中进行测序。原始序列先使用 Geneious 版本 9.1.7 (Kearse et al., 2012) 进行编辑，然后再在 MAFFT (Katoh amp; Standley, 2013) 中对齐，然后在必要时进行手动调整。产生的所有序列都上传到 GenBank（表 S1）。

因为在 Manen 等人的这两个核标记中鉴定了“流氓分类群”（2010），系统发育分析用贝叶斯推理方法进行。比对的核苷酸替换模型由 jModelTest2 (Darriba et al., 2012) 确定。 Beast 版本 2.4.3 用于系统发育分析 (Bouckaert等人，2014年) ，在物种形成过程中选择了严格的时钟模型和出生死亡模型。分析历时 2 亿代，每 1000 代取样一株。在 Tracer1.6版中检查了有效样本大小值，其中所有有效样本大小值均 gt;220% ，老化值为 30% 。LogCombinor 版本 2.4.3 用于丢弃 30% 的树作为老化树并将树重新采样到小于 10 000。最后，在 TreeAnnotator 版本 2.4.3 中使用其余的重采样树生成了最大分支可信度树。

2.2 利用大型化石标定发散时间

我们根据三个大型化石记录了估计发散时间。首先，我们选择了最古老的科纳莱斯(Cornales) 化石记录，也就是小行星中最基本的一目，作为阿奎弗利亚目 (Aquifoliales) 的冠龄。这块化石名为 Hironoia fusiformis M. Takahashi、PR Crane amp; SR Manchester ，是从科尼亚纪时代 （86.3-89.8 Ma） 的煤化果实中描述的（Atkinson 等人，2016 年）。在此约束条件下，以89.8 Ma的圆锥曲线为根龄，并设定为均匀先验分布的最大下限这一限制的最小界限是基于中欧最古老的冬青大型化石(一颗种子)，其年代为69 Ma (Knoblohamp;Mai，1986) 。其次，以晚中新世 (5.3-11.63 Ma) 的原角果香川里和白年太阳的叶宏体化石为最小分枝的茎节下限。因为 I. protocornuta 与活的 I.cornuta 很接近（Li et al., 2010）。在我们的系统发育中，这一最小包含角果的分支包括三个种：I.cornuta、I.dimorphophylla Koidz.和 I.zhejiangensis CJ Tseng。在此约束条件下，采用5.3 Ma和69 Ma的年龄作为均匀先验分布的最小和最大界限。最后，在Loesener分类系统的Aquifolioides组中，用来自欧洲渐新世的I.Castellii Kvaček et Walther的叶宏化石记录，作为Oxyodontae亚组的茎年龄 (Loesener，1942年；Kvaček et al.，2009年) 。以 23.03 Ma和 69 Ma的年龄作为均匀先验分布的茎节的最小和最大界限，其中包括Loesener系统中属于棘齿目亚组的所有样本物种。

2.3 祖地重建

样本物种分布的数据来自多个在线开放资源，包括中国植物志（Chen等人，2008年）、水青科植物志（Loizeau amp; Barriera, 2007年）、全球生物多样性信息中心 （GBIF, 2018年） 和世界植物在线（POWO，2019年）。为了重建冬青的祖先区域，我们定义了七个分布区域：（i）亚洲（包括北澳大利亚、新几内亚、博宁群岛和密克罗尼西亚）；(ii) 大洋洲（包括新喀里多尼亚、瓦努阿图、夏威夷群岛和法属波利尼西亚）；(iii) 非洲（包括马达加斯加）；(iv) 欧洲（包括地中海地区）；(v) 加那利群岛-亚速尔群岛（包括亚速尔群岛、马德拉群岛和加那利群岛）；(vi) 北美洲（包括中美洲和加勒比）；(vii) 南美洲（见图 2B）。基于计算的最佳拟合模型（Matzke，2012），在“BioGeoBEARS”包中推断系统发育中每个节点的祖先区域重建。所有的分析都是基于七个分布区和最大分支可信度树，并用Beast分析中产生的化石校准。该分析是在每个节点中使用最大数量的区域约束 (lt;2) 进行的。

2.4 生态性状的祖先状态重建

关于系统发育中每一物种的叶缘、果色、果直径和最大树高的数据是从网上获得的，包括它们的模式标本、中国植物志（Chen et al., 2008） )、水生植物专著网站(Loizeau amp; Barriera, 2007)、印度 eFlora (eFlora of India, 2019) 等。利用R软件项目(R Core Team，2019年)中的“Phytools”软件包(Revell，2012)中的单速率模型对果实颜色和叶缘进行祖先状态重建。利用“Phytools”中“fast Anc()”函数中的极大似然估计法，对果实直径和最大树高进行祖先状态重建。重建结果也通过使用“phytools”包在热图中可视化。叶缘和果实颜色的系统发育信号使用 R 中的 EM-Mantel 测试进行检验，这是一种基于进化模型的检验，具有适当的I型误差和强大的检测连续性状和分类性状的系统发育信号的能力(Debastianiamp;da Silva，2017)。用“picante”(Kembel等人，2010年)中的“phyloignal()”对果实直径和最大树高的系统发育信号进行了检验。

2.5气候耐受性的进化测试

我们从全球生物多样性信息设施(GBIF，2018)、中国虚拟植物标本馆(CVH，2015)和我们自己的实地考察中获得了地理参考标本记录。总共收集了177种植物中的163种植物的35004条分布记录，并与世界在线(POWO，2019年)和GBIF(GBIF，2018年)中植物的自然分布范围进行了人工核对。使用Python3.6中的Amap API(2019年)对CVH中的位置数据进行地理编码。通过与Python3.6中冬青属的自然全球分布进行比较，进一步清理了这些数据，去掉重复项后留下了21657条唯一记录。为R包“RASTER”中的每条记录提取了切尔萨的19个生物气候变量(Karger等人，2017年)(Hijmans，2019年)。使用“picante”软件包中的“phyloignal()”函数测试了所选生物气候变量的系统发育信号(Kembel等人，2010年)。

结果

冬青属由 5 个进化枝和 22 个主要子进化枝组成（图 1）。大多数节点的后验概率高于 0.8，除了最多样化进化枝的尖端附近（图 1，S1）。东亚、欧洲、北美和南美洲的物种不形成单系群，但三个最基础的进化枝（A-C）完全是欧亚大陆的，进化枝 A 和 B 中的三个物种都生长在中国西南地区 1000-3000 米的高度。进化枝 D 包括亚洲和美洲的物种，而进化枝 E 包括来自现代全球范围的该属物种。其拓扑结构与Manen等人的核树基本相似(2010)，但增加了 61 个物种可以提高的分辨率，特别是在

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