微卫星标记应用于束带蛇的多父本鉴定外文翻译资料

微卫星标记应用于束带蛇的多父本鉴定

原文作者 G. F. McCRACKEN ,* G.M.BURHARDT and S.E.HOUTS*

摘要： 从普通的束带蛇的四个微卫星位点获取的数据显示，多父本现象在密歇根的比弗岛上的一个自然种群中很常见。对6组实验对象进行实验，每组有8窝幼蛇，每一窝有5只或更多的幼蛇，并且加上母本。至少幼蛇数目最多的一窝的实验结果为3父本（n=13）。在自然种群中一串模式和基因型频率表明在一个微卫星位点上无效等位基因的存在。束带蛇广泛应用于定量遗传学研究，并且亲子鉴定在依靠亲属分析的研究中至关重要。

关键词：行为遗传学；交配系统；微卫星；无效等位基因；束带蛇

引言

束带蛇是研究行为学，遗传学和发育的模式物种(Burghardt 1993)。这些胎生的束带蛇可以生育一大窝幼蛇，并且从出生开始，幼蛇就可以用来研究各种各样行为特征的差异。已经证明显著的遗传差异影响了束带蛇的新生幼蛇的抗捕食能力，觅食能力，环境应激性和自发反应。(评论于 Brodie amp; Garland 1993; Burghardt amp; Schwartz 1999)。在估算遗传学中，同窝后代的单父本或多亲缘关系已经被广泛呈现（例如Arnold 1981）。然而，至少在束带蛇(Schwartz et al. 1989)的一些种群中多父本是常见的这种现象指出在行为遗传学的研究中对所有物种和种群测试假说和亲子鉴定是非常重要的。

施瓦茨等（1989）使用四个多态异构型酶位点，记录已经检查过的32窝中的16窝后代的多父本现象，并估计多父本现象存在于16窝中的72%。并且对异构型酶位点的回归线性分析估计在r=0.390的多父本繁殖的后代中的平均亲缘关系是混合的，有完整的亲缘和不完整亲缘(Schwartz 1989）。考虑到r=0.390是一个真实的同窝幼蛇的亲缘关系，以对完整亲缘关系的错误猜想为基础的计算将会低估大约为35%的真实的遗传，并且会增加这些估计的标准误差。

在这里我们将报告微卫星基因标记的发展会提高检测束带蛇的同窝新生幼蛇多父本现象的能力。我们记录这些微卫星标记在分析从比弗岛中采取的束带蛇的效力，并且我们报告关于一窝束带幼蛇至少有三个父本的第一份文件。

材料与方法

1.样品

1996年6月在美国沙勒沃伊县的一个2公顷的比弗岛的鸟栖息地，采集怀孕的母束带蛇(Thamnophis sirtalis)。这些蛇被运输到田纳西大学，它们喂养与单独的笼子里，直到它们产出幼蛇。在母蛇生产之后，从每只母蛇中通过静脉穿刺收集1毫升的血液，以及1厘米的尾巴尖端从而为母蛇的DNA提取提供血液和组织。新生的幼体束带蛇被分开饲养并且对它们进行一系列的行为特征测试(Burghardt amp; Schwartz 1999; Burghardtamp; Krause 1999)。在行为特征测试之后，从每只幼蛇中收集0.05毫升的血液用于亲本鉴定。在行为特征测试中或者之后死亡的幼蛇中移除它们的肌肉和肝脏组织。

2.数据建设和筛选

DNA数据库的建设被K蛋白酶分解，而蛋白酶被从饲养过程中死亡的成年雌束带蛇的5克肌肉组织中提取到的苯酚-氯仿-乙醇提取物消化(Sambrook等.1989)。10微克的DNA被MboI消化，并且这些比125bp还小DNA碎片，用100微升的集中器转移。将这些被消化成小碎片的DNA绑定到已经被BamHI用脱磷酸化和消化的大肠杆菌上。将质粒插入已经转入DNA的大肠杆菌中，并将大肠杆菌培养在硝基XL2-blue ultracompetent细胞中，而细胞培养在镀斯奈尔膜(Scheichter amp; Snell Ltd)和LB 氨苄青霉素介质琼脂板上。根据两个简单的重复序列(AAT)8(GT)12,得到两组数据，而这两个重复序列已经预先用[32P]-ATP和T4多核苷酸激酶进行标记(New England Biolabs)。化学的克隆根据放射自显影法和两轮复制电镀与选择从而得到区分。17对小于600bp的基因通过桑格双脱氧终止链的方法和M13或者T3引物进行测序(Integrated DNA Technologies)。在最初的DNA复制中，在至少7个不间断的重复中微卫星放大了4个位点(Table 1)。

表格1：从束带蛇中得到的4个微卫星位点的属性(GenBank accession nos AF135963–AF135966)

3.聚合酶链反应(PCR)扩增,电泳和放射自显影法

从血液中用苯酚-氯仿提取液分离的用于亲子鉴定的DNA，在30微升的集中器中纯化然后用0.1*Tris-EDTA buffer悬浮离心。PCR扩增是在12-L反应物中进行，反应物包括1.2L of 10*PCR buffer (Promega)， dATP，dGTP， dTTP 和 dCTP 各0.06L (5 mm) (Promega)，每种底物0.07L (1 pmol), Taq DNA聚合物 0.2L(5 units/L) (Promega) 加上1L (10 ng/L)模板DNA。最适浓度的MgCl2 0.29L (0.6 mm)用于位点1，0.38L (0.8 mm)用于其他位点。在每个反应中，上游引物使用T4多核苷酸激酶作为结束标记。加入无菌水从而获得最终的反应体系。每个体系中加入一滴矿物油，防止蒸发。

PCR扩增反应周期性循环中进行，DNA扩增的条件由95C12分钟，之后是56C1分钟（位点1），54C1分钟（位点2），57C1分钟（位点3），或者是55C1分钟（位点4）这阶段是27次循环，最后一分钟是72C。反应产物是在4%聚丙烯酰胺产品(19:1bis-acrylamide)和 8M尿素凝胶中以60-80W恒功率电泳大约2.5小时。凝胶用3毫米的层析滤纸保住，在真空环境和80摄氏度下干燥1小时，并且用X-射线照射24-96小时。测序反应在每个凝胶中增大PCR产物的大小。

结果

1.遗传多样性

在四个微卫星位点上观察到了高水平的多态性。等位基因的总数符合每个位点的范围，位点三有4个,位点2有18个。在比弗岛的束带蛇种群中，检查评估专属于野生成年的束带蛇的后代的杂合性和等位基因的频率。在幼蛇种分别发现，15对等位基因在位点Ts1和Ts2，有6对等位基因在基因座Ts3和Ts4。在雌束带蛇中观察杂合性，范围是从0.82( Ts1)到0.72(Ts2)。

在成年雌束带蛇种杂合子和纯合子的频率在位点Ts1，Ts2，Ts3，Ts4上符合哈伯-温伯格定律的预期(G-test, Pgt; 0.05)。在位点Ts2(G-test, P=lt;0.05)上观察到的一个重要的关于杂合子缺陷表明在这个位点可能存在一个或多个不增加的非等位基因。在每窝每个位点，有孕的雌束带蛇的等位基因遗传与孟德尔定律没有区别(Binomial test, Pgt; 0.39 in all cases)。在位点Ts2上非等位基因（或等位基因）的存在也由新生幼蛇和雌蛇的基因型支持。在第三窝中的八个或九个新生幼蛇的基因型中发现明显缺乏独特的等位基因(Table 2)。

2.父本鉴定

每窝有4到13只幼蛇则可以检测母本和幼蛇的基因型，这些后代中在一个位点有三个及以上等位基因的6窝，从而证实这些是多父本(Table 3)。至少两个不同位点表现出多父本现象，并且在基因型都是确定的后代中检测出多父本现象。在第一窝的位点Ts1上5对等位基因的出现证明这窝至少有三个父本(Table 2)。

用最大可能性估计在每窝后代中所有可能的多位点父本基因型的比例贡献。在所有可能的基因型中，至少有两个父本的窝中10个最大可能父本的估计贡献的平均在0.68和0.83之间，而在至少有3个父本的第一窝中，平均值为0.46(Table 3)。这一分析表明，父本在可育后代中并不平等的共享。

表格二：第1、3、5窝母本和幼蛇的基因型

表格三：多父本鉴定、在每个微卫星位点上的父本等位基因的数目、最大可能性的父本基因型估计的比例的贡献

讨论

我们的实验结果表明在束带蛇的种群中多父本的概率非常高，并且与施瓦茨等（1989）早些时候估计的75%的后代存在多父本现象的这一结论非常接近。并且，正如施瓦茨等报告的一样，我们检测可育后代父本情况的能力增加了在一个位点上出现的等位基因的数量(Tables 1 and 3)。不像施瓦茨等人已经研究过的内陆的束带蛇，比弗岛上的束带蛇种群有本质上更少的后代。在施瓦茨等人的研究中，有检测到多父本现象的后代数的范围是11-40，而没有检测到多父本现象的后代数的范围是5-12。同一窝中幼蛇的数量和位点的数量之间的关系对检测出多父本现象是至关重要的(r= 0.81, Plt; 0.0001)。在最近的研究中，在每窝幼蛇数量很少的种群中也有检测多父本现象的实验，高频率的多父本现象在这个种群中出现的原因是未知的；然而，在蛇类中多父本是众所周知的，这种行为可以增加后代的可行性，并且后代的质量可以通过不同雄性的精子的竞争得到加强(Madsen et al. 1992)。比弗岛接近于束带蛇最北的限制范围，在比弗岛上后代数量少的原因可能是由生态因素造成的。束带蛇后代数量的减少众所周知显示了地理差异，但是这个的原因并没有建立(Gregory amp; Larsen 1993)。然而，越大的雌性有越多的后代这是显而易见的(Rossman et al. 1996)。在最近的研究中，有一个积极的但是没有意义的后代总数量和母本身体的长度之间的关系(r=0.408, P= 0.248)。如果更大的雌蛇能够吸引更多的雄蛇，那在更多的后代中，多父本发生的概率可能会更高。事实上，决定后代数量多有更高概率的多父本现象是复杂的，因为在后代数量少得情况下检测多父本是困难的，还有一个问题由微卫星提供的更大的等位基因的多样性所缓解。未来的 研究将探索多父本现象和母本的大小以及后代生育能力的关系。

虽然施瓦茨等人研究了大量的后代数量多的案例，没有一窝需要超过两父本来负责父本等位基因的贡献。在这里，高等位基因多样性的另一个结果是，我们记录了在一窝中的7对等位基因（2对来源于母本，5对来源于父本），至少确认了三父本现象。

感谢

我们感谢Barbara Manzer, Matthew Lanier 和Mark Krause对捕杀蛇的禁止，和Dr Gareth Russell 在父权最大似然分析这方面的帮助。我们感谢James Gillingham在比弗岛中央密歇根大学提供的物质和设施支持。我们也感谢McCafferty家族允许我们在比弗岛他们的土地上收集成年蛇。这项工作是有美国国家科学基金会提供的资金支持IBN94-11140。

参考文献

Arnold SJ (1981) The microevolution of feeding behavior. In: Foraging Ecology: Ecological, Ethological, and Psychological Approaches (eds Kamil A, Sargent T), pp. 409–455. Garland Press, New York, NY.

Brodie ED III, Garland T Jr (1993) Quantitative genetics of snake populations. In: Snakes: Ecology and Behavior (eds Seigel RA, Collins JT), pp. 315–362. McGraw-Hill, New York, NY.

Burghardt GM (1993) The comparative imperative: genetics and

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