环境污染物DDE未能影响海洋龟绿海龟性分化的结果外文翻译资料

环境污染物DDE未能影响海洋龟绿海龟性分化的结果

原文作者 Suzana Podreka, Arthur Georges, Bill Maher, and Colin J. Limpus

摘要：在大多数的乌龟种类中，通常是由温度在中间的蛋孵化决定后代的性别。像是引发性别决定的类固醇性激素隐藏着开启内分泌失调干扰物也许会影响性别分化的结果的可能性。在这项研究中我们调查DDE（一种常见DDT的代谢物）对性分化的绿海龟潜在影响。分别从四个地方，苍鹭岛、昆士兰，澳大利亚收集卵，用DDE在性决定热敏期开始治疗。这个物种中，28°C或更低的孵化温度会产生雄性幼体，而30 ` C或以上会产生雌性幼体。因此使卵在在这个物种的性别决定的阈值的上、下边界的两个不同的温度（27.6°C和30.4°C)下孵化。DDE的范围从3.3到66.5微克，溶解在5，10，和25的皮升乙醇中，应用于上述胚胎蛋壳。小于2.5ng／g的DDE目前是在卵之前给药。大约34%的应用DDE都被卵吸收，只有约8%的应用DDE在胚胎中发现。因此，处理过的卵，DDE的校正背景，有高达543ng／gDDE。这些剂量的性别比例并没有不同于只对温度进行考虑。孵化时，孵化成功率，身体畸形的发生率，孵化的大小和体重都应考虑在卵健康发育的范围之内。这表明绿海龟的卵在野外DDE的浓度小于543ng／g时应该产生较高的孵化率，孵化成活率，及正常的诱导分化的性腺。

关键词：龟鳖目; DDT; 内分泌失调干扰物; 温度依赖性测定;

引言

在大多数的乌龟种类中，中间第三的孵化温度决定了后代的性别。最近有证据表明，类固醇性激素是最接近的触发性别决定，虽然温度影响胚胎发育的激素平衡或激素受体的机制尚未完全了解。实验室里的复合物的实施如三苯氧胺、17beta;-雌二醇、雌二醇苯甲酸酯和丙酸睾酮，会影响后代的性别，这开启了内分泌失调干扰物在野外会影响幼体的性别比例的可能性。DDT的代谢产物DDE，和多氯化联苯复合物（PCBs）是可能的候选人，并应该得到特殊关注，因为他们是最常见的积聚在动物组织的污染物。

虽然DDT在一些国家禁止，但它仍广泛应用于发展中国家，这种杀虫剂及其衍生物是公认的环境污染物。DDT在脂肪组织中积累，并逐步代谢为比DDT更为持久的DDE。

在19世纪70年代，估计DDE每年以超过12000吨速率最终进入海洋。其中的一些吸附于海底沉积物，大部分则进入海洋食物链。曾经在一个有机体，DDE可以影响内分泌系统，从而影响成长，发展，和繁殖，其中胚胎阶段似乎是最容易受到内分泌失调干扰物的影响的发展阶段。异常发育，胚胎畸形，死亡率增加，以及较低的孵化成功率已经被证明是因为在一个范围内的生物体包括爬行动物在内的DDE污染。

在海龟中，DDE积聚在脂肪组织，并最终传递给卵。DDE浓度发生在龟和其他爬行动物的卵中在他们的自然环境已在许多研究中测量，但这种污染物对胚胎的影响却很少提到。在这篇文章中我们研究DDE污染对海龟绿海龟后代的性别比例和胚胎发育的影响。在野外采卵背景DDE水平也进行测量，并与其他研究中（表1）爬行动物的卵所发表的DDE水平和外用DDE在溶液中的有效性进行了评估。

1. 材料与方法
   1. 卵的来源

1995年1月12日，新鲜的卵分别从苍鹭岛，昆士兰，澳大利亚的四种雌性绿海龟处收集，并使卵温度冷却到12°C，空运回澳大利亚首都领地的堪培拉大学。所有的卵被分配到72小时内的实验孵化器。首先，所有的卵都放在温度设置为27.5°C的孵化器中在等待评估其生活能力。将卵安置在5升圆塑料食品容器中，容器中覆盖有潮湿的蛭石（三份蛭石四份水的重量）。经过15天的潜伏期后，卵的表面开始变白，这表明发育已经开始。在检查卵时十分谨慎小心，以免震动或转动它们，因运动而引起的死亡病例都有据可查。将不肿胀或缺乏白色斑块的卵去除，余下的卵则合并入最小的容器中，为分配给实验做准备。

• 1. DDE的背景水平

四个离合器（表2）中的十五个卵用于DDE的背景水平的测定。它们在27.5°C孵化直到21期（15天的潜伏期），然后解剖。通过与标准系列的比较，确定了胚胎期，从壳和壳膜中分离白蛋白，清液、卵黄和胚，并进行冷冻。

白蛋白、液、卵黄、胚胎中DDE的浓度的测定方法根据在鸡蛋中测定所推荐的方法进行改良。样品进行匀浆后和约5克的复制样本进行称重，放置在玻璃的景明管中。添加乙腈（纳米，25ml；克罗特菲利普斯堡，NJ）并在密封管中用手动摇2 min，然后在2500rpm下离心5min。含DDE的上清液（25毫升）倒出稀释至100毫升去离子水。用乙腈水溶液（50毫升）采用串联C18净化（Alltech Associates公司，迪尔菲尔德，IL）和Florisil固相萃取柱（奥特奇Associates，Inc.）。柱子用100%乙酸乙酯(omnisolv; EM Science,Gibbstown, NJ)和100%正己烷（纳米；Mallinckrodt）以流速1毫升/分钟的速度洗脱。收集洗脱液，浓缩至2毫升（用温水浴和液态的高纯氮），用DDE使用配有电子捕获检测器的气相色谱仪（配备hp-5890 hp-1和BP-10系列Series II GC毛细管柱，hp7673自动注射器；休利特帕卡德公司，北岸，澳大利亚）进行分析。每个样品重复测定来获得DDE在卵组织中的评估，加标样品的DDE回收率高（全蛋：98plusmn;23%

胚胎：101plusmn;6%）。

• 1. DDE曝光

卵的给药是在性别决定期开始（21期），用2,2-二（4-氯苯基）- 1,l二氯乙烯（P，Prsquo;—DDE；纯度99%；Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI)溶于乙醇。用在300毫升95%乙醇0.8 g DDE的原液准备0.67，1.33，2.00，和2.66 mu;g/mu;l的稀释，并应用于鸡蛋5，10，和25 mu;l的等分。这有两级控制：没有进行给药的卵和给予一个三个数量的乙醇（表3）的卵，因为还没有实验对绿海龟胚胎的乙醇影响进行研究。大约有20个卵用于每个实验的制度。DDE的解决方案是将直接用吸管吸到到蛋壳表面（局部应用），立即覆盖胚胎。这是首选的DDE注入鸡蛋和避免在注射中从蛋壳渗透中产生不可接受的死亡率的方法。其中一个12个卵的子样本，2 /剂量，来评估在一系列的DDE浓度和数量的乙醇（表3）中的DDE的渗透度程度，而其余的卵孵化作为在孵化时DDE的影响部分实验。

• 1. DDE的吸收率

卵在27.6°C下孵育直到28期（49天），这认为是绿海龟热敏期的结束。确定上述DDE浓度，分别为胚胎和剩下的部分（不包括蛋壳和外壳膜），进行背景DDE水平的校正。以下DDE的局部应用，用于估计在下面描述的性别鉴定实验DDE剂量的吸收率。

• 1. DDE的孵化影响

卵的给药的DDE用量根据上述实验制度。卵在21期时放置在两个设定为30.5°C的孵化器和两个设置为27.5°C的孵化器中。因此，有8-12枚卵在每个实验中设置其孵化温度。在没有污染的情况下，在较高温度下孵育的卵预计将产生约100%的雌性幼体；孵化温度较低时，预计将产生约100%的雄性幼体。观察到的任何给药的卵的性别比例的变化将因此由DDE、乙醇的影响，或是在胚胎发育时两者在给药时间（21期）和胚胎的性别决定期（27期）的结束来解释。

将十六枚卵放置在容量为5升圆塑料食品容器中，容器中覆盖有潮湿的蛭石（三份蛭石四份水的重量）。将卵分配以确保卵接受16种不同的处理，包括控制在每个容器中，来自四种离合器的卵的代表。容器装有盖子，允许气体交换，同时最大限度地减少水的损失，将容器放置在四个孵化器中进行孵化。水托盘放置在每个孵化器的底部，以保持在孵化室足够高的但不能测量的潮湿度。孵化过程中，对容器的重量进行监测，但不需要补充水。在孵化器中的实际温度，将水银温度计放置在靠近卵，与认证协会的澳大利亚温度计检测部门监测进行校准，分别为30.4plusmn;0.6℃和27.6plusmn;0.40℃。

小海龟在阶段28时用戊巴比妥钠进行颅内注射标记进行移除，并保存在10%福尔马林中。他们的体重接近0.01克，头部的宽度和直背甲长度测量可以精确到0.1毫米。对孵化成功率和任何幼体畸形都进行记录。对正常的性腺、肾脏复杂性，以及每个幼体相关联的管道都用石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色进行处理。在光镜下根据米勒和limpus建立的标准，对每个性腺进行评估。 在评估有误处进行二次检查。

1. 结果
   1. DDE的背景水平

未经处理的卵含有在1.3ng/g 和2.4ng/g 之间的DDE（表2）（平均plusmn;标准误差，1.7plusmn;0.3，n = 15）。其中有一个显着增加方差分量是由于在DDE浓度离合器之间的差异（F = 5.96；DF = 3,11；P＜0.05）。卵在离合器A中（2 ng/g）有着比离合器B中（1.5 ng／g）或D中（1.5ng／g）（Tukey多重比较检验；P＜0.05）（表2）较高的DDE浓度。在离合器A和C（1.7 ng／g），或B、D和C中（表2）没有显着差异。

• 1. DDE的吸收率

单独被施加回归对DDE的量由整个蛋内容物（不包括壳和外壳膜）溶于DDE的量和胚胎和乙醇的体积用于施加DDE。一旦DDE应用量是包含在模型中，在DDE没有进一步的变化可以由所用的乙醇体积解释。DDE的吸收可以从使用以下公式预测施加的DDE：DDE _{uptake by the whole egg}=0.3387 x DDE _applied -0.2339; DDE _{uptake by the embryo}= 0.075xDDE_appIid- 0.0545。其中，DDE为微克，DDE _appIid介于6.7mu;g 与66.5mu;g之间。双方关系的斜率均显著（公式1：F =206.6; df =1,2; P lt;0.01; R²=0.99;公式2:F=179.7; df =1,2; P lt;O.01，R² =0.99 ），但截距不是。因此，DDE的约三分之一应用于渗透卵（图1），与约8％的DDE用于胚胎吸收；因此，水平高达543ng/g的DDE暴露在高达溶解在25mu;l乙醇的66.5mu;g的DDE的卵中进行预测。

• 1. DDE的孵化影响

以防由整个卵溶于DDE的预测幼体性别的多重逻辑逐步回归，乙醇的量应用和孵化温度表示该温度下单独施加一个对后代性别的影响（X²=204.0; df =1; P lt;0.0005）。一个鸡蛋在27.6℃，产生一个雌性幼体的概率为9％，而在30.4℃时为94％。性分化的预测结果基于温度的单独的效果是一致的（雄性在低温和雌性在高温孵化）。因此，我们不能证明，是DDE还是乙醇在任一温度影响幼体性别。

多重逻辑回归也用来探索胚胎存活率和由整个卵吸收的施加了乙醇的DDE的量，以及孵化温度之间的任何关系。只有发现孵化温度对胚胎存活率存在显著效果（x²=21.7; df = 1,P lt;0.0005）。相比于在30.4℃的概率为72％，卵在27.6℃孵化的概率为94％。

孵化到破壳而出，畸形率、幼体尺寸和重量均对整个卵的预计总DDE倒退，这适用于每

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