微卫星标记的使用和评估实用指南外文翻译资料

微卫星标记的使用和评估实用指南

原文作者 Kimberly A. Selkoe1,2 * and Robert J. Toonen2

摘要： 遗传分析和基因分型方法的最新改进使得分子标记解决生态问题的力量迅速增强。微卫星已成为生态学应用中最流行和通用的标记类型。近年来，某些商业服务的兴起，使得制备新的研究物种和基因样本的微卫星的价格合理，这表现为生态学家有空前的能力去采用遗传学方法而无需在专用设备上大量投资。然而，由于在使用遗传工具的实用性和弊病方面缺乏易得的综合信息，阻碍了生态学家使用分子生物学方法做出明智的决策，同时由于合成微卫星无需了解评估遗传数据集合的品质所需的步骤，从而造成一定的风险。本文的第一个目的是为微卫星标记以及在商业服务的帮助下分离和使用微卫星的风险、成本和时间要求等方面的优点和局限做一个概述。第二个目的是为了鼓励彻底标记筛选的使用和相一致的报告，以确保高品质的数据。为此，我们提出了一个多步骤的筛选过程来评估候选基因位点以列入遗传学研究，其广泛性获得了初学者和经验丰富的遗传学家的一致好评。

关键词：非同源相似；连锁；标记隔离；孟德尔遗传；微卫星；分子生态学；中性；无效等位基因；群体遗传学；简单重复序列

引言

在过去的十年中，遗传学的方法来解决生态问题已变得更为高效，有力和灵活，因得到广泛的应用。遗传标记如等位酶，微卫星和线粒体与核DNA序列可以被用来估量生态学家所感兴趣的问题，例如迁移率，人口规模，瓶颈，亲缘关系等等（详见表1）。微卫星已经在某种程度上成为这些研究最受欢迎的选择，因为它们具有提供当代个体迁移估量的潜力，能够区分出随机交配区的迁移率相对较高，并且可以估算个体的亲缘关系。近来，一些关于遗传分析技术的的评论细节层出不穷，可以解决生态学问题 (Bossart amp; Prowell 1998; Cruzan 1998; Davies et al. 1999; Luikart amp; England 1999; Shoemaker et al. 1999; Sunnucks 2000; Manel et al.2003, 2005; Beaumont amp; Rannala 2004; Pearse amp; Crandall 2004) 。 这些评论鼓励生态学家采用基因的方法，但至今没有发表的文章或手册，以指导初学者采用和应用这些技术更实用的一面。本文作为这些评述的姊妹篇，旨在平稳应用群体遗传学的学习曲线。然而，首次尝试使用微卫星同样需要大量阅读本文列举的技术论文并向有经验的群体遗传学家寻求指导。

近来分子生态学的技术不断进步，有两个不同的促进因素。首先，实验室技术已经变得精简，更经济，并且能够使用大量的样本和位点。其次，计算技术的进步，激发了密集型统计方法的采用，如最大似然法、贝叶斯概率论与蒙特卡罗马尔可夫模拟链。这些新方法比传统方法的数据统计在数据集方面使用更多的信息（例如，F_ST，一种跨人口等位基因频率差异的计算方法）。因为如今的数据集包含10²-10³个个体，这些个体从多个位点取样而来，更加强而有力地详尽描述群体和个体的关系的人口结构及历史。这些进步使得许多基本生态问题在遗传工具的帮助下首次或以新的方式得以解决（表格1）。在过去的5-10年中，几十种软件程序使用上述统计工具已经得以开发以解决这一系列的问题 (见Pearse amp; Crandall 2004) 。许多生物学家还不知道，在很多情况下，使用遗传工具不再需要投资昂贵的设备和实验台的技能。现在有些商业服务将开发可以应用于几乎任何物种的新标记，许多其他的公司和集中的大学设施，将从组织样本中提取和收集DNA基因型，并在几周内以合理的费用发送回一个完整的数据集合。这些服务及其相对较低的成本是医学科学中标记隔离和基因分型的应用，如疾病连锁图谱等的普及的直接结果。为了方便分子生态学的初学者的成功使用微卫星，本文的第一个目的是对微卫星的使用利弊进行了概述。虽然微卫星标记隔离在某些特定类群中仍然存在问题，但新标志隔离和基因分型在广泛的类群（包括大多数脊椎动物，许多昆虫和一些植物）已经成为常规，使得其使用无需在实验室内部的实验室进行。本文的第二个目的是概述进行新的微卫星标记的隔离的步骤及其相关费用，为进行群体遗传学研究的生态学家和初学者提供信息需要，以决定是否投资使用遗传工具。本文的第三个目的是通过提供一个六步微筛查方案，以鼓励对遗传数据集进行全面的品质检测。一个初学者在研究过程中，由于正式的方案尚未建立在文献中，特别容易忽略其中的一个或更多的重要步骤。重要的是，希望通过本文的我们的筛选方案，鼓励所有生态遗传学家、初学者或经验丰富者

采取这些重要步骤作为更连贯和全面的报告。

表1：使用中性遗传标记来解决一些生问题态的小结，由数据所需类型排序

See Pearse amp; Crandall (2004) and other references in text for more detail.

*These analyses might require gt;10 microsatellites – the number is inversely correlated with the degree of genetic differentiation across

populations. Species with low migration rates and/or small populations will require fewer loci.

Using gt;1 locus will substantially dampen interlocus sampling error.

Often requires microsatellites, but also possible with AFLP and RAPD fingerprinting techniques – see Sunnucks 2000 for marker comparison.

RAPD, random amplified polymorphic DNA; AFLP, amplified fragment length polymorphism.

第一部分：微卫星综述

什么是微卫星？

微卫星是以1-6个核苷酸为单位的串联高频率重复DNA序列，常见于大多数类群的核基因组中。因此，它们也被称为简单序列重复（SSR），可变数目串联重复序列（VNTR）和短串联重复序列（STR）。由于广泛使用的微卫星，我们对其基因组和整个类群的突变、功能、演化与分布的理解正在迅速增加(Li et al. 2002; Ellegren 2004)。一个微卫星位点的重复长度一般在5〜40之间，但重复更长的字符串也是可能的。而二核苷酸，三核苷酸和四核苷酸重复是分子遗传学研究中最常见的选择。其中，二核苷酸重复占许多物种微卫星的绝大多数(Li et al. 2002)。三核苷酸和六核苷酸重复序列常出现在编码区，因为它们是最可能不会引起移码的重复类型(Toth et al. 2000)。单核苷酸重复序列由于其扩大问题不太稳定；更长的重复类型不太常见，且能够检验其演变的数据非常少。(Li et al. 2002)

围绕微卫星基因座的DNA被称为侧翼区。因为侧翼区的序列通常在相同物种的个体中是保守的（即相同的），有时在不同物种中亦是，一个特定的微卫星基因座常常可以通过其侧翼序列鉴定。DNA的短延伸，被称为寡核苷酸或引物，可被设计成结合到侧翼区，也可用聚合酶链反应（PCR）引导一个微卫星基因座的扩增。具体对PCR引物的微卫星标记隔离的有形产品（下文详述;见补充材料附录S1）。商业服务中寡核苷酸的普及使得它能够简单地排序任何未标记的引物序列，并将它在交付给你为20美元/天（DNA测序需要使用荧光标记的引物目前80美元）。

同侧翼区不同，微卫星重复序列的DNA复制过程中由于滑动和校对错误经常发生变异，这主要改变重复的次数，从而重复字符串的长度(Eisen 1999)。因为等位基因的长度不同，它们可通过高分辨率凝胶电泳得以区分，这使得许多位点的个体的快速基因分型只需DNA测序的价格的几分之一。 许多微卫星具有很高的突变率（每代每个位点的突变10^-2和10^-6之间，平均位5times;10^-4），其产生的等位基因多样性的高水平必要性作用于生态时间尺度过程的基因研究 (Schlouml;tterer 2000) 。

为什么选择微卫星？

如今分子生态学中有多种可广泛使用的标记类型，很多问题都可以用多于一种以上的类型的标记进行处理（表1）。对不同的标记类型进行的全面概述在其他文献中也有提供(Avise 1994; Sunnucks 2000; Zhang amp;Hewitt 2003; Schlouml;tterer 2004) 并且超出了本研究的范围。微卫星是生态学家特别感兴趣的标记，因为它们是少数让研究人员见识到精细尺度的生态问题的分子标记之一。可以想象，例如，植物生态学家研究开花时间。使用微卫星标记，我们的研究人员可以处理各种有趣的问题，例如：个体或群体的花从早开花的和晚开花的基因不同吗？不要移民倾向花与他们的邻居或自己的本命人口同步？迁移者倾向于和周边花类一起开花还是它们先天所在的种群？适宜措施（花期，花数，结实等）和基因型之间有关系吗？就其适宜措施而言，在某特定一年的是开花最好的吗？

不管这些问题，分子标记必须从根本上是选择中性并遵循孟德尔遗传规律才能被用来作为一种工具，用于检测人口结构，且这些特征应始终用以确认任何标识类型（见第三部分：一个微卫星筛选方案）。

在这里，我们概述微卫星的优势特性与其他标记类型的比较，如等位酶，扩增片段长度多态性（AFLP），测序基因位点和单核多态性（SNP），主要集中在两个实际问题和生态因素进行比较。

1.样品易制备

一个理想的标记允许使用易保存以备将来使用小的组织样本。对比等位酶的，基于DNA的技术，例如微卫星，使用PCR技术从一分钟组织样品扩增所需的标记物。与酶相比，DNA的稳定性允许存储使用简单的组织防腐剂（如95％乙醇）。此外，由于微卫星的长度通常比测序基因座更短（100-300与500-1500bp）。尽管有些DNA会讲解但它们仍然可以通过PCR得以扩增 (Taberlet et al. 1999)。随着DNA降解，它分解成更小的碎片和成功扩增长段的机会与其长度成正比(Frantzen et al. 1998)。此特征使得微卫星同古DNA或从毛发和粪便样本中的非侵入性采样用DNA一同应用于快速和廉价的DNA提取方法中(Taberlet et al. 1999)。此外，由于微卫星是物种特异性的，由非目标生物体产生的交叉污染相较于使用通用引物（即引物，将扩增来自任何物种DNA）少得多，如与AFLP技术相比。当与排泄物样品或物种接触，如礁石珊瑚，其中共生细菌污染实际上是不可避免的，因此这个特性是特别重要的。

2.高信息含量

每个标记位点可以被认为是一个样本基因组。由于重组，选择和遗传漂变，不同的基因和基因组的不同区域有略微不同的家谱历史。依靠单一的轨迹从基因数据来估计生态特征使得抽样误差率很高。因此，使用多种从多个位点相结合的结果中得到的基因样本为比较种群和个体提供了一个更精确和更有说服力的方式。此外，能够解决生态学家家最感兴趣的问题的统计方法，往往需要多个可比较的基因位点(见表1and Pearse amp; Crandall 2004)。虽然AFLP、等位酶和随机扩增多态性DNA（RAPD）的技术也是多位点的，但它们都没有多位微卫星研究的分辨率和功率（但对于不同的原因，见Sunnucks2000）。尽管AFLP标记对微卫星而言可以是一个很好的替代选择(Bensch amp; Akesson 2005)。Gerber等. (2000)表示，159位点的A

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