开花时间调节剂FCA和FPA在RNA介导的染色质沉默中的广泛作用外文翻译资料

开花时间调节剂FCA和FPA在RNA介导的染色质沉默中的广泛作用

Isabel Bauml; urle,1* Lisa Smith,2dagger; David C. Baulcombe,2Dagger; Caroline Dean1*

摘要：RRM结构域蛋白FCA和FPA以前被认为是拟南芥开花时间的调节因子。我们发现它们是RNA介导的基因组中一系列位点染色质沉默所必需的。在某些靶位点，FCA和FPA促进DNA不对称甲基化，而在另一些靶位点，FCA和FPA的作用与DNA甲基化平行。雌配子体发育和早期胚胎发育特别容易发生FCA和FPA的功能紊乱。我们认为FCA和FPA调节单拷贝和低拷贝基因的染色质沉默，并以基因座依赖的方式与典型的小干扰RNA导向的DNA甲基化途径相互作用以调节共同的靶点。

许多生物体中的H-染色质的特征是广泛的DNA甲基化和组蛋白修饰(1)。植物在CG、CNG(N=任意核苷酸)和CHH(H=A、C或T)序列上下文中显示胞嘧啶甲基化。在拟南芥中，小干扰RNA(SiRNAs)参与定位和维持这些染色质修饰的过程，需要RNADEPENDENT RNA POLYMERASE2(RDR2)、DICER-LIKE3(DCL3)、ARGONAUTE4(AGO4)和两个RNA聚合酶IV亚型，Pol IVa和b(2-9)。

为了确定siRNA介导的染色质沉默所需的其他组件，我们使用了一种报道基因系统，其中拟南芥八氢番茄红素去饱和酶（PDS）基因响应同源反向重复（SUCPDS）而被沉默(10)。两个部分抑制PDS沉默的突变体（图1，A，B，C和E）显示了后期开花，可​​通过春化来逆转。沉默和开花表型共分离，并且突变定位于染色体2和4。开花表型表明，FPA和FCA是自主途径的两个成员(11)，涉及到那些基因组区域。测序显示FPA（Trp⁹⁸*，G至A，fpa-8）和FCA（Gln⁵³⁷*，C至T，fca-11）中的过早终止密码子。通过与先前已知的开花突变体（fca-9，fpa-7和fve-3；图1F）进行互补分析确认了开花缺陷，该突变体也显示PDS沉默（图S1）。因此，需要FCA和FPA在存在SUC-PDS的情况下实现有效的PDS沉默。

FCA和FPA包含多个RNA识别基序（RRM）RNA结合结构域(12、13)，其中RNA不共享其他序列同源性。FCA通过替代性聚腺苷酸化位点的使用来负面调节其自身的表达(14)。fca和fpa的晚期开花是由于拟南芥开花的主要阻遏物FLOWERING LOCUS C(FLC)的过度表达所致(11)。在没有沉默触发的情况下，FCA和FPA似乎没有调节PDS，这表明转基因的存在使内源性PDS成为FCA和FPA的特征。

由于FCA和FPA都包含RRM域，因此我们假设它们的作用是部分冗余的。与此相一致，一个fca-11 fpa-8双重突变体显示没有PDS沉默（图1D）。 siRNA染色质沉默途径的组成部分（Pol IVa是最大的亚基NRPD1a和RDR2）也完全抑制了PDS沉默(10)。nrpd1a-5和fca-11 fpa-8双重突变体均显示出降低的SUC-PDS和较高的PDS mRNA水平（图1G和图S2）(10)。PDS siRNA水平在rdr2-5，nrpd1a-5和 fca-11 fpa-8突变体中降低，但在fca-11或fpa-8单突变体中未降低（图1H）。

亚硫酸氢盐测序用于研究PDS沉默是否与内源PDS基因座处的DNA甲基化相对应。我们在SUC-PDS叶片中与发夹互补的区域的内源PDS基因座中发现了非CG甲基化（CNG和CHH），而在野生型叶片中则没有（图1I和表S1）。在野生型和突变体中，CG位点都高度甲基化。在nrpd1a-5和fca-11 fpa-8突变体中，siRNA的丢失与不对称DNA甲基化的丢失同时发生（图1I和表S1）。尽管PDS siRNA水平不受影响，但在fca-11和fpa-8单个突变体中CHH甲基化也受到损害（图1，H和I）。这些结果表明了FCA和FPA的双重作用：(i) 与NRPD1a和RDR2相互冗余，相互冗余地扩增源自转基因基因座的siRNA。(ii)它们在目标基因座的沉默信号的感知和解释中起作用。自主途径的其他两个成员（MSI1同系物FVE和推定的组蛋白脱甲基酶FLD(15、16)的突变体也抑制了PDS沉默（图S1），这表明该过程涉及自主途径的多个组成部分。

转座子，逆转录元件和基因间转录本是染色质沉默途径的内源性靶标(5-8、17)。FCA和FPA也控制了AtSN1元件和AtMu1 DNA转座子的表达（图2A）。在fpa-8，fca-11，fpa-8和nrpd1a-5突变苗中，AtSN1的激活非常强烈，但在fca-11中却没有。相反，AtMu1在fca-11和fpa-8单个突变体中略微降低，而在fca-11 fpa-8中则更弱。 fca-11 fpa-8中的AtMu1重新激活与nrpd1a-5中的类似。在fca-11 fpa-8中，侧翼是一个长末端重复序列（LTR）的基因间转录物也被上调，其程度要小于nrpd1a-5（图2A）。迄今为止，这些发现表明FCA和FPA在调节内源基因座中具有广泛的作用，该内源基因座已知在转录水平上是沉默的并且依赖于siRNA。

接下来，我们研究了这种转录重新激活是否与相应的siRNA丢失相关。在fca-9，fpa-7和fca-9 fpa-7中以野生型水平检测到AtSN1和AtMu1 siRNAs，但在nrpd1a-3突变苗中却没有（图2B）。其他siRNA也获得了相应的结果。因此，尽管它们在PDS siRNA的扩增中发挥作用，但FCA和FPA通常不依赖于NRPD1a的siRNA产生。 fca fpa中AtSN1位点的DNA甲基化没有变化（图2C，图S3，A和B和表S2）。但是，亚硫酸氢盐测序表明fca fpa中AtMu1处的不对称（CHH）DNA甲基化减少了约50％，而CG和CNG甲基化未受影响（图2C，图S3B和表S2）。同样，单独LTR处的不对称DNA甲基化也降低了（图S3C）。维持不对称DNA甲基化需要触发器的持续存在，而对称DNA甲基化则可以在不存在触发器的情况下通过细胞分裂来维持。这些位点的沉默也与组蛋白尾部修饰的改变有关，例如增加的H3 K9二甲基化和减少的H3 K4二甲基化(5、8、17)。使用染色质免疫沉淀，我们在fca-9 fpa-7中没有发现这些标记的任何明显改变。

图1. FCA和FPA抑制SUC-PDS引起的PDS沉默。（A到E）SUCPDS背景中的叶片表型生长很长时间。 （A）Col，（B）fpa-8，（C）fca-11，（D）fca-11 fpa-8，（E）无转基因。比例尺，5毫米。（F）互补分析：所示突变（白色，自交）和fpa-8（黑色）或fca-11（灰色）之间杂交的F1子代的平均开花时间（plusmn;SEM）。 （G）检测内源性PDS（PDS）和SUC-PDS mRNA（*）的PDS mRNA的RNA凝胶印迹分析。数字表示在两个实验中平均的PDS相对表达。（H）SUC-PDS siRNA的RNA凝胶印迹分析。（I）通过亚硫酸氢盐测序测定的内源PDS基因座处的胞嘧啶甲基化。

异色基因座是由多个沉默途径靶向的，它们对单个基因座的贡献差异很大(18-20)。我们的发现证实了这一点，即在存在SUC-PDS的情况下，对AtSN1，AtMu1，IG/LINE和PDS的沉默要求不同FCA和FPA。PDS沉默通过依赖于siRNA染色质沉默途径和fca fpa的机制与靶DNA甲基化和siRNA产生相关。在fca fpa突变体中，AtMu1和IG/LINE的抑制与DNA甲基化的丧失相符，但与siRNA的丧失相符，而在siRNA染色质沉默途径的突变体中都缺失。尽管在fca fpa中AtSN1的激活作用强得多，但DNA甲基化和siRNA积累均不受影响。我们的发现与这样的想法是一致的，即转录可以在DNA甲基化的情况下重新激活，这是针对吗啡分子1（mom1）突变的证据(19，21)。尽管有这种相似性，FCA和FPA似乎不太可能与MOM1一起起作用，因为在mom1中AtSN1和AtMu1并未受到错误调节(22)。

为了研究FCA和FPA如何与染色质siRNA扩增途径（包括Pol IVa，RDR2和DCL3）相关，我们分析了双突变体中沉默的释放（图2D）。所有双突变体均显示出比任何单个突变体高得多的AtSN1和AtMu1激活，这表明FCA和FPA并不在siRNA扩增途径的下游起作用，而是并行发挥作用。同样，相对于单个突变体（图S3D）中的任何一个，在fve nrpd1a双重突变体中转座子的激活都大大增强了。令人惊讶的是，尽管FCA对于野生型的AtSN1沉默是必不可少的，但nrpd1a，rdr2或dcl3突变体背景下FCA的缺失大大增强了AtSN1沉默的释放。

我们的发现预测，fca fpa突变体中DNA甲基化的扰动将以不同方式影响目标基因座的重新激活。在AtSN1，FCA和FPA的作用与DNA甲基化脱钩，在存在DNA甲基化抑制剂5-氮杂-脱氧胞苷（aza-dC）的情况下，沉默的损失会增加。相反，在AtMu1，fca fpa突变体显示出DNA甲基化降低，该抑制剂的附加作用很小。我们的结果（图3A和表S3）与该预测一致，因为就AtSN1激活而言，fca-9 fpa-7突变体对azadC的敏感性比野生型高，而对AtMu1的敏感性比野生型低。重新激活。同样，当暴露于aza-dC时，野生型或fca-9幼苗的发育并非异常且fpa-7幼苗的发育仅非常轻微的异常时，fca-9 fpa-7幼苗的发育受到强烈干扰。（图3B和表S4）(23)。

fca fpa双重突变植物开花较晚，但在其他情况下则基本正常。但是，仔细检查fca-11 fpa-8角果后发现，约20％的正在发育的种子已中止，约70％的胚珠未开始发育（图S4A和表1）。当用野生型花粉对双重突变体进行授粉时，没有种子流产，但仍有大量未发育的种子持续存在。这一发现表明，胚胎致死性是合子的，而未发育的种子表型是由母体的基因型引起的。当用野生型花粉对fca/fca FPA/fpa胚珠进行授粉时，34％的种子似乎未发育（表1）。显微镜检查成熟胚珠未发现任何异常（图S4，B和C），这表明雌配子体的基因型决定了未发育的种子表型。

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