三维生物打印和它的体内应用外文翻译资料

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三维生物打印和它的体内应用

生物3D打印的目的就是能原位设计和创造出有功能的3D组织或器官并能在体内运用，3D细胞打印，换句话来说就是能选择生物材料和细胞（墨水）的生物制造和对含有细胞的组织的高精度加工。3D细胞打印也被用于应用如研究模型，药物传递与发现，和毒理学等方面。 最近有很多人尝试通过使用3D打印技术制造组织和器官。 然而，很多挑战比如血管化的问题都尚待解决。 本文回顾了近年来使用3D细胞打印技术的优点和缺点。 此外，本文也介绍了3D生物打印在体内应用的最新成果，同时讨论了未来的3D细胞打印技术的前景。

1. 简介

自1950年以来，器官移植已经拯救了数百万疾病不能治愈的人的性命，但是这个过程的需求远远大于捐献者捐献的数量。一种可被替代的方法需要被提供去满足日益增加的等待接受移植的病人的数量。此外，器官移植受固有的免疫响应和器官排斥所限制。组织工程提供了一个有吸引力的解决方案克服器官移植的限制。 3D生物打印产生于额外加工制造技术（AM，也被称为3D打印），并在过去的十年中有着显著的进步，是组织工程中能提供实用性和可能性的再生医学手段。附加加工制造技术提供了制造有序的组织构造来修复或替换损坏的或患病的人体组织的可能性.。3D生物打印克服了基于支架的组织工程技术的缺点，例如通过生物墨水的逐层打印，限制了结构复杂性和空间异质性，在一种无支架的形式中，以模仿自然结构目标组织。它能够制作材料具有广泛选择性，使具有或不具有细胞的生物材料处于精确的受控的位置，最终形成目标组织或器官。

将3D生物打印的组织或器官在生物反应器中温育至体外成熟，通过手术或原位印刷进行移植，在这种情况下是人体作为生物反应器。3D生物打印有三个制造组织和器官的方法：生物模拟，自主组装和微型组织积木。最常见的3D生物打印系统是激光直接的写作，喷墨挤压和细胞电纺系统。每个系统有它的优点和缺点，因此处理不同的生物墨水需要细胞和细胞所需的生物相容性材料，或用于支持。目前已经为生物打印组织做了许多尝试，范围从简单的组织，如骨，软骨和皮肤，到更复杂的组织如脉管系统和人体大耳软骨。3D生物印刷的应用不仅限于更换患病组织，也用于药物输送等领域。

细胞活力，细胞的精确放置，血管化是制造完全功能的、致密的和大尺寸的组织和器官限制因素。最近，综合组织和器官打印系统已经能产生具有相关临床尺寸和完整的有细胞活力的人造组织，但仍然存在一些问题，如血管化问题需要解决。目前最有希望的方法将是科恩等人的工作。摄像机系统解决了可视化和不能浏览生物印刷过程的缺陷。机器人可视化系统和生物打印系统之间的合作是临床使用必不可少的。目前还有一些需要解决的问题，并且需要进一步的工作使细胞生物打印在临床环境中得到验证。

尽管3D生物印刷技术取得了进步，但是没有成功的临床使用案例。这篇综述包括3D生物印刷或经过了动物试验和临床试验阶段的组织工程中的添加剂制造，但不包括组织工程中的3D打印或支架制造。从这一点开始，文章将会阐述最先进的3D生物印刷技术，包括其特征，优点和局限性。此外，它将描述组织和器官在体外或体内的3D生物印迹。最后，它将讨论3D生物打印中的挑战及其未来前景。

二、3D生物打印的体内应用

3D生物印刷已经成为组织工程最有希望的方法，因为它具有几何控制的能力以及能控制用于制造构建体的生物材料的量。要生成更大，更通用的组织或器官还有一些问题需要解决，如细胞活力和印刷组织的血管化。3D生物印刷中的最先进的技术，已经在体内进行了评估，在表四中进行了总结。血管化的组织是制造人体组织的主要限制因素，因此体内印刷受到营养扩散的限制，只能打印出尺寸很小的组织（几毫米）这一点影响了它的临床能力。

骨组织

骨组织是在3D生物印刷领域中最常见的硬组织类型。制作与天然骨组织机械强度和结构相似的骨组织，是这一领域的关键挑战。骨组织构造需要互连多孔结构来用于管化和细胞增殖。为了能3D打印出这样的构造，已经开发出了许多种方法。如开发出了赋予生物聚合物强度的杂交构建体，使用装载细胞的溶液来制造这样的溶液，以提供结构完整性和强度，而其他的则使用单一含细胞液的生物印迹骨组织溶液。

De Coppi等人制造了一个结构：通过羊膜的逐层印刷使用流体来源的茎（AFS）细胞并且含有藻酸盐/胶原蛋白的生物油墨进行骨组织再生。HP Deskjet 550C打印机已修改用于印刷结构。体外结果显示将AFS细胞分化为功能性成骨细胞，能促进碱性磷酸酶表达和分泌。对于体内评估，将构建体在成骨培养基中培养一周，并在免疫缺陷小鼠中皮下植入。18周后，能以比小鼠股骨更大的密度观察到硬骨样物质[图2（b）]。

在Keriquel等人的研究中进行了n-HA的体内印刷[图2（c）]以辅助骨修复。利用石英带和钛吸收层的激光辅助生物印刷，组装在称为HT-Bio LP的自设系统中。如图2（d）所示，免疫缺陷小鼠的临界大小颅骨缺损在3个月内用成熟骨组织完全恢复，其中n-HA层印刷在该位点上。另一项研究还旨在修复小鼠的颅骨缺损，并研究生物材料和细胞的有效的逐层结构。Catros等人 48提出了通过使用LAB如图2（e）所示的将细胞接种的生物材料层印刷在电纺聚己内酯（PCL）支架上的两种混合结构。体外细胞增殖分析显示，逐层（LBL）设计结构，大约2周的培养后，细胞增殖更大。此外，体内植入小鼠颅骨缺损的构建体显示在LBL构建体的位置形成更厚的纤维组织[图2（f）]。

已经有许多尝试制造用于在关节区域如膝盖中再生组织的骨软骨构建体。Shim等开发了一种多头组织/器官构建系统（MtoBS），可以在单个系统中打印众多生物材料。它采用基于挤出的系统，一些采用加热设备和两个打印头。 一个用于打印软骨细胞/藻酸盐混合物用于软骨发育，另一个用于骨的MG63（成骨细胞系）。这些生物蛋白印刷到PCL框架中，细胞活力没有显着降低（软骨细胞：93.960.3％，成骨细胞：ge;95.661.8％）。

康等人制造了具有临床有用尺寸和完整性的几种组织构建体。引入集成组织器官打印机（ITOP）以通过具有气动挤出系统的多盒模块来制造多个构建体。该组创建下颌骨和颅骨，分别在成骨培养基中体外培养并在体内成熟。两种骨组织构建体具有91％的高细胞活力和5times;10 6细胞/ ml的高细胞密度。微通道确保氧和营养物扩散，即使当构建体大小高于扩散极限时，细胞也能增殖。通过在小鼠中植入颅骨骨构建体进行5个月的体内评估后，在整个植入物中观察到新形成的血管网络，这是临床使用适合性的积极信号。

皮肤组织

皮肤是由许多细胞类型和功能结构如汗腺和血管组成的复杂组织。目前已经进行了许多3D生物印迹尝试以创建皮肤组织，并且已经成功地增强了在体外和体内评估的皮肤的恢复和生长。然而，其厚度受到限制，因为不存在向细胞提供必需的营养物和氧气的血管化。此外，患者发病率、对周围的天然组织的低粘附性和高的制造成本是需要解决的一些限制。需要通过印刷皮肤组织结构中的内皮细胞的血管网络或其他一些手段进行印刷并保持大皮肤组织结构的活力。

像骨组织的体内生物印迹一样，Skardal等人研究了皮肤组织的体内生物印迹，用于治疗小鼠模型中的大伤口。将间充质干细胞（MSC）或羊水来源的茎（AFS）细胞悬浮在纤维蛋白/胶原凝胶中，用于生物印迹到免疫缺陷小鼠的皮肤伤口上[图3（a）]，与对照（仅凝胶）相比，经MSC处理和AFS细胞处理的部位具有较厚的组织再生与血管形成[图3（b）]。AFS细胞处理的构建体比MSC处理的构建体分泌更多的生长因子，并且体外结果显示内皮细胞迁移，其中体内结果不显示任何。

迈克尔等人进行了LAB技术创建的皮肤构造的体内测试，以根据设计的3D空间模式精确排列细胞。成纤维细胞/胶原层和角质形成细胞/胶原层印刷在Matriderm片上以进行稳定[图3（c）]。使用免疫缺陷小鼠的背部皮肤折叠室，印刷的皮肤构造覆盖皮肤伤口[图3（d）]。11天后，构建体与周围组织完全连接，角质形成细胞形成致密的多层表皮。此外，观察到一些血管从伤口床和边缘生长到细胞周围。

电喷雾的皮肤组织构建体也被皮下植入小鼠的背侧，以证实生物电喷雾没有显着损害细胞活力和功能。植入的构建体的H＆E染色结果在植入两天后没有显示出细胞的显着损伤。

皮肤组织构建体的体外培养由Lee等人在形态学和生物学上类似于具有高细胞活力（〜95％）的体内人类皮肤组织进行，他们发现用于构建3D皮肤组织构建体的最佳印刷条件[ 图3（e）]。 在空气 - 液体界面培养物中浸泡7-14天后，观察到具有稀疏人造真皮层的非常致密的表皮层[图3（f）]。 此外，观察到表皮隔膜中的3-7个底层和具有大的细胞 - 细胞接触的良好形成的屏障。

软骨组织

徐等人开发了由静电纺丝和喷墨打印设备组成的混合印刷系统。静电纺丝装置产生聚合物纤维基支架，其为构造提供额外的机械强度。喷墨平台具有由步进电机和直流电磁铁驱动的定制的XYZ绘图仪喷墨阀。其构造具有三个电纺PCL / pluronic F-127层的交替层和两个喷墨印刷的软骨细胞凝胶层[图4（a）]。将其在体外培养2周，并植入免疫缺陷小鼠。在植入后8周，分析了移植组织，观察到密集，组织良好的胶原蛋白形成与其在对照样品中形成的很少相比[图4（b）]。 此外，混合构建体中具有空隙的GAG和圆形软骨细胞的形成类似于天然弹性软骨。

通常研究软骨组织的生物印迹来修复骨软骨缺损如膝关节。Shim等人使用定制的多头组织/器官构建系统（MtoBS）来制造异质组织[图4（c）]。将软骨细胞和成骨细胞印刷到PCL框架上，在第1天具有高细胞活力（ge;90-94％） [图4（d）]。在构建体中氧气和营养物质运输的孔允许细胞在没有扩散的情况下以一厘米级的大小增殖。

对于软骨和骨软骨修复，Cohen等人用临床允许的错误研究了原位生物印迹.5 Fab @ Home AM系统被修改，允许容易交换材料和附加激光距离传感器进行几何计算。对于软骨缺损修复，印刷[图4（e）]和骨软骨缺损印刷[图4（f）]，平均误差lt;0.1 mm，临床范围内。虽然这种方法受到身体适用区域、材料的选择的限制，证明了现场维修系统的可能性。

崔等使用光聚合制备了机械稳定的软骨修复构建体[图4（g）]。具有人软骨细胞的水凝胶是印刷在骨软骨塞（3D生物纸）上[图4（h）]。构建体的机械强度接近天然人软骨的395.73680.40kPa，培养6周后，与周围组织牢固连接，蛋白多糖和GAG含量增加 [图4（i）]。

如骨章节中已经提到的，Kang等人制造了一种耳软骨构建体，并将其皮下植入免疫缺陷小鼠。10个月后植入，构建体内成熟良好，变得更具弹性和机械强度。此外，由于微通道，在整个构建体中观察到新的软骨组织形成。然而，GAG含量仅达到20％的天然软骨组织，表明有待改善。

Kundu等人利用了多头挤压系统 打印软骨组织构建体[图4（j）]，并在小鼠中皮下植入4周。检索结构的组织学分析显示软骨组织形成和II型胶原原纤维形成增强[图4（k）]。使用PCL框架改善了构建体的机械稳定性，而GAG和胶原纤维结构确保了细胞增殖和健康软骨组织的形成。 然而，分层结构的细胞活力（〜85％）略低于单层（〜95-97％），这是需要解决的问题。

Shim等人使用了称为多头组织/器官构建系统（MtoBS）的挤压系统。制造多层非均质关节组织结构.软骨下骨层和浅表软骨层由含有人鼻甲衍生的间质基质细胞的胶原蛋白溶液明显制造（hTMSCs）和成骨生长因子，以及CB [6] -HA与hTMSCs和软骨形成生长因子的溶液。构建体的组织染色在兔子的关节植入8周后，在整个构建体中显示出新生成的组织，与附近的天然组织整合。

其他组织

生物印迹中的大多数研究集中在制造用于骨，软骨和皮肤组织再生的构建体。其他的总结在表IV中。人造血管的许多构造是概念证明，表明将细胞悬浮的生物材料印刷成所需的结构的可能性。许多工作仍在进行体内评估，但是难以模仿天然血管的生物和机械性质。

可以将印后制造添加到生物印刷组织或器官的过程中，以将印刷细胞分化成期望的细胞类型。Faulkner-Jones等 已经从已经成熟为肝细胞样细胞的人诱导多能干细胞（hiPSC）和人胚胎干细胞（hESC）制造了微型肝。 这是使用基于阀的生物打印系统30进行的，该系统对细胞活力没有不利影响（ge;84％）。 该组建立了一个3D藻酸盐矩阵。 在21天的分化方案之后进行的分析显示白蛋白分泌峰值，这意味着该构建体是肝脏性质的。

神经细胞具有再生和神经保护功能，通过将神经干细胞置于感兴趣的部位来提供替代功能障碍或损伤的神经组织的信誉。神经组织的一个关键特征是细胞间细胞通讯，其可以通过形态结构。3D生物印刷系统具有以高度受控的几何形状印刷生物材料的能力，这是发展神经组织的重要因素。

Hsieh 等已经制造出能够在成年斑马鱼中进行神经恢复的构建体。本研究中使用的生物材料可以改善中枢神经系统功能。将8层含有PU2（聚氨酯分散体）的神经干细胞（NSCs）挤压成构建体，并植入具有人造损伤小脑的成熟斑马鱼.PU2是NSCs的优良载体，但其低模量限制了构建体的厚度。康等通过使用ITOP系统打印肌肉构造。在植入小鼠2周后，其成熟度足以维持结构形成并诱导肌肉纤维形成之后的神经整合。肌肉构建体的功能与未成熟的发育中的肌肉相似。需要进一步的工作来查看该构造是否可以在功能和结构上完全替代原生肌肉组织。使用相同的系统从肝组织球体制造肝脏构建体。

结论和未来的展望

该综述提供了不同的3D生物印刷技术，用于

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