在甲基丙烯酰胺明胶水凝胶内软骨内骨的形成与嵌入软骨衍生基质颗粒外文翻译资料

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在甲基丙烯酰胺明胶水凝胶内软骨内骨的形成与嵌入软骨衍生基质颗粒

增长骨骼系统中软骨内骨形成的自然过程越来越激化骨组织工程领域。然而，为了产生相关尺寸的骨移植物，需要确保高扩散速率并促进基质形成的细胞载体，由其降解来平衡。因此，我们开始使用具有多层基质细胞（MSCs）和软骨衍生基质（CDM）颗粒的明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）水凝胶中的软骨内骨。发现CDM颗粒在体外在GelMA水凝胶中刺激MSCs形成软骨模板。在皮下大鼠模型中，随后将该模板改造成矿化骨组织，包括骨髓腔。 GelMA在此过程中几乎完全退化。在具有或不具有CDM颗粒的GelMA中，分别具有42.5plusmn;2.5％相对于39.5plusmn;8.3％（平均值plusmn;标准偏差）的凝胶化程度没有显着差异。有趣的是，在骨软骨环境中，一半构建体中的软骨细胞的存在完全阻碍了MSC在另一半中的骨形成。这项工作为相关尺寸骨移植物的工程提供了一条新途径，通过在可降解的水凝胶内形成软骨内骨。介绍

近年来，通过软骨内路径的工程骨骼越来越受到关注[1]。 这种方法是基于我们对于发育中的胚胎[2]和骨折愈合过程[3]上长骨骨骼的不断增长的了解。 长骨的形成开始于间充质基质细胞（MSC）的冷凝，然后分化成软骨细胞。 这些软骨细胞分泌软骨特异性基质，富含II型胶原和糖胺聚糖（GAGs）。 在终末肥厚分化过程中，软骨细胞随后招募负责软骨模板的骨化和排空的细胞混合物[4]。

然而，骨组织工程传统上集中在模拟膜内途径[5,6]。这个过程比软骨内骨化更直接，而且自然发生在例如颅骨骨头中的形成[2]。修复大骨缺损的方法的一个主要缺点是工程化组织的尺寸有限[5]。大型工程骨构架需要快速血管化，以便在构建体的核心中提供足够的氧和营养物质的细胞。成骨和血管祖细胞的共培养或先进血液预先构建的工程可提供解决方案[5,7,8]。或者，软骨细胞在缺氧条件下能够很好地发展，从而可以克服这一限制[9,10]。此外，骨折的自然愈合依赖于骨折愈伤组织中的软骨内骨质增生[3]。在这种情况下，软骨形式预分化的MSC聚集培养物已经显示能够重现体内软骨内骨形成过程[11e13]。此外，这些肥大细胞聚集体和软骨移植物刺激节段性骨缺损中的软骨内骨形成[14,15]。

为了增加软骨内骨形成构建体的尺寸，可能需要支架作为细胞或细胞聚集体的载体，如最近为生物可降解聚合物或有机骨架材料所示[13,16,17]。 我们还开发了通过软骨组织去细胞化获得的成像基质（CDM）[18,19]。 在该过程之后，CDM主要由II型胶原组成，不存在GAG和细胞。 生物化学提示被认为保留在这种可以引导细胞分化的细胞生物材料中[18]。最近，我们已经显示这些CDM支架是通过接种MSCs来体外软骨基质形成的合适的模板[19]。 然而，水凝胶可能优于干燥（有机支架），因为它们的降解特性是可定制的，生化提示可以

容易引入细胞命运[20]，并允许制造多相结构[21,22]。

理想地，水凝胶促进细胞的增殖和冷凝，形成软骨模板并随后重塑成骨。 鉴于我们以前在该凝胶中观察到的广泛的软骨基质形成，凝胶甲基丙烯酰胺（GelMA）水凝胶可以是合适的底物[23,24]。 GelMA水凝胶通过改进甲基丙烯酸酯化程度和聚合物浓度，可酶促降解和可调谐用于特定的再生应用[24e26]。 例如，除了软骨再生之外，还可以在GelMA凝胶中建立功能性血管网络[27]。

本研究的目的是在GelMA水凝胶与CDM颗粒的复合材料中通过软骨内途径设计相关尺寸的骨组织当量。 这种复合生物材料是为了从生物活性中获益而创造的

CDM，同时保持GelMA系统的多功能性。 我们通过嵌入GelMA / CDM的MSCs和随后的异位大鼠模型中的体内软骨骨形成来评估体外软骨基质的形成。 具有和不具有CDM颗粒的GelMA中的软骨细胞用作对照组。 此外，在软骨层软骨细胞的双层结构中研究了MSC的骨形成，以评估GelMA对骨软骨组织形成的潜力。骨软骨组织形成

2。材料和方法

2.1。 实验装置

目的是评估GelMA水凝胶中的软骨内骨形成嵌入CDM颗粒。为了 确定在水凝胶中最佳浓度马-CDM颗粒，测试了各种浓度的CDM颗粒对GelMA机械性能上。MSCs在体外培养长达六周（表1）， 软骨细胞的软骨特异性基质形成标准着软骨形成。 两种细胞类型均并入GelMA，不含CDM颗粒（分别为CDM 和CDM）。在大鼠皮下植入8周后，相同组评估体内软骨形成和软骨内骨形成。 此外，植入双层样品以评估软骨细胞对其的影响骨髓内软骨成骨能力。

表格1

实验装置。 软骨细胞的软骨分化能力MSC在体外测试了CDM颗粒在GelMA中的作用。 后来，将样品植入大鼠皮下8周评估软骨形成和软骨内骨形成。

2.2。生产CDM颗粒

全身软骨从尸体关节（膝盖）收获由于其他原因已被安乐死的健康捐赠者（3-10岁）

而不是关节病，经主人同意。根据Benders等人的方案，软骨合并去细胞化[19]。之后在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤软骨切片，在液氮中冷冻并冻干过夜。然后，将软骨在液氮中（A11基础分析研磨机，IKA，Staufen，德国）研磨几分钟以增加在下面的化学处理中的接触面积，这些都是在摇床上以2000rpm进行。用软骨颗粒处理六个循环的0.25％胰蛋白酶-EDTA（Invitrogen）在37℃共48小时。颗粒然后用PBS洗涤并用进行4小时处理，并用

50U / ml脱氧核糖核酸酶（Sigma）和在10mM Trise HCl（pH7.5）中的1U / ml核糖核酸酶A（Sigma），37℃。接下来，用10mM处理颗粒低渗TriseHCl持续20小时，然后是1％（v / v）Triton X-100在PBS中24小时，两者在室内温度。将颗粒在PBS中充分洗涤6个循环48小时总的来说为了除去所有的酶剂。软骨细胞悬液将PBS中的颗粒冻干过夜，并将颗粒再次在液体中研磨氮气通过300mm的孔筛分。 CDM的长度和宽度使用ImageJ软件从2D光学显微镜图像测量颗粒

2.3。马-软骨细胞和多能基质细胞的分离

经业主同意在无菌条件下收获健康的全层软骨新鲜马尸体（n frac14; 3, age 3e10 years）的健康的全层软骨。在37℃下经破碎 和胶原酶隔夜消化成II型碎片后（Worthington Biochemical Corp），过滤悬浮液通过100mm的细胞过滤器，在PBS中洗涤并储存在液氮中在培养基（Dulbeccos Modied Eagle Medium（DMEM）41965）中在196℃下，Invitrogen），补充有20％热灭活的胎牛血清（FBS，Bio-Whittaker）和10％二甲基亚砜（DMSO（Merck，Darmstadt，Germany））。上解冻，软骨细胞以5,103的密度接种细胞/ cm 2和在软骨细胞扩增培养基中的单层培养物中扩增10天12天由DMEM，10％FBS，100单位/ ml青霉素和100mg / ml链霉素组成（Invitrogen）和10ng / ml FGF-2（R＆D Systems），并在通道中嵌入GelMA 1。

经当地动物伦理委员会批准，骨髓抽吸胸骨从健康的活马供体获得（n = 3，3e10年份）。 通过将样品离心分离单核级分（MNF）Ficoll-Paque（Sigma）。 将MNF以2.5times;10 5的密度接种细胞/ cm 2和在单层培养基中扩增，直到MSC扩张培养基中的亚细胞扩散含有a-MEM（22561，Invitrogen），补充有10％热灭活FBS，0.2mML-抗坏血酸2-磷酸（Sigma），100u

/ml青霉素和100mg / ml链霉素和1ng / ml FGF-2，并在通道中嵌入GelMA3E4。从骨髓培养的细胞的多重电位通过如前所述的三向分化测定来研究吸出物描述[19,28,29]。

2 .4。 用CDM颗粒和细胞制备GelMA

GelMA通过A型明胶（SigmaeAldrich，St.Louis，Missouri，USA）与甲基丙烯酸酐（SigmaeAldrich）在50℃下反应1次小时，如前所述[24,30]。 总之，在恒定搅拌下滴加甲基丙烯酸酐到PBS中10％的明胶溶液中。 达到一个高度的官能化，每克添加0.6克甲基丙烯酸酐的明胶。 将官能化聚合物用蒸馏水透析7天在40℃下除去甲基丙烯酸和酸酐，用10％碳酸氢钠（Merck，Darmstadt，Germany）中和至pH 7.4，冷冻干燥并储存在-20℃直到使用。 该方法的官能化程度约为75％[24]。 将解冻的GelMA以10％（w / v）的浓度溶解在70℃的含有光引发剂Irgacure 2959（Ciba，BASF，Ludwigshafen am Rhein，德国）PBS中，最终浓度为0.1％（w / v）。 将CDM颗粒混合各种浓度，见第2.5节）。 然后将软骨细胞或MSC悬浮在水凝胶中，106细胞/ ml用于活力测定，浓度为20,106细胞/ml用于体外和体内分化分析。 对于机械分析，具有1.3mm高度和8e9mm直径的线形GelMA样品为UV-以180mW / cm 2的强度交联（350e450nm，紫外线技术，慕尼黑，德国）。 对于所有其他测定，载有细胞和CDM的GelMA为在定制的空气密封模具中交联15分钟（样品尺寸约8 8 2毫米），在UVP CL-1000L交联剂（UVP，Upland，加利福尼亚州，美国）。

体外培养软骨细胞样品，

补充培养基（DMEM（41965，Invitrogen）），补充有0.2mML-抗坏血酸2-磷酸盐，0.5％人血清白蛋白（SeraCare Life Sciences），1 ITS-X（Invitrogen），100单位/ ml青霉素和100mg / ml链霉素，25mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）（Invitrogen）和5ng / mlTGF-beta;reg;2））和MSC载体样品在MSC软骨形成分化 - 补充培养基（DMEM（31966，Invitrogen）），补充有0.2mML-抗坏血酸2-磷酸，1times;ITSthorn; 预混物（BD Biosciences，USA），0.1mM地塞米松（SigmaeAldrich），100单位/ ml青霉素和100mg / ml链霉素和10ng / mlTGF-beta;2（R＆D Systems））。每个供体进行3次重复体外培养1次生存力测定为14天，体外分化为4周和6周。体外分化预培养两周用于软骨细胞和MSC（每个供体）。通过成型工艺将具有软骨细胞的层交联到具有MSC的MSC的层中创建双层GelMA样品（高度：2times;2mm），并在50/50软骨细胞/ MSC软骨细胞分化的培养基条件下预培养2周。 这样做是为了评估软骨细胞在体内对MSC软骨形成的影响。

2.5。样品稳定性和压缩模量

为了找出在保持稳定的交联构件的同时可以并入的最大量的CDM颗粒，在凝胶状物中，CDM颗粒在GelMA中以1％，1.5％，2％，3％，4％和5％（w / v）的浓度混合。 100毫升将没有细胞的GelMA / CDM混合物光连接并保持软骨细胞分化培养基在37℃下培养1周，之后是样品宏观评估。另外，这些样品的刚度在室温下用动态不定形压缩测量机械分析仪（TA仪器，DMA 2980）。从0增加到5 N的力对样品表面施加0.5N / min的速率（直径8e9mm）。在压缩过程中记录位移和施加力基于初始样本尺寸转换为应力和应变。该绘制应力曲线曲线，并计算压缩模量该曲线的线性部分的斜率。样品的失效定义为伴随着压力的下降突然解体。

2.6。 活力测定

为了可视化细胞活力，根据制造商的说明书进行LIVE / DEAD活性测定（Molecular Probes MP03224，Eugene，USA）。 使用Olympus BX51显微镜检查样品用奥林巴斯DP70摄像机拍摄的照片（奥林巴斯，荷兰）。 激发/发射滤光片设置在488/530nm以观察活的（绿色）细胞和530/580nm处检测死（红）细胞。 活死细胞每个时间点在3个样本中计数，每个构建体内的4个位置（软骨细胞和MSC，两个1个供体）。 活力计算为（活细胞/总数）细胞计数）100％。

2 .7. 体外培养：组织学，免疫组织化学和生物化学

每个样品的一半用组织学和免疫组织化学处理，另一半生物化学。 因此，一部分脱水通过分级乙醇系列，在二甲苯中清除并嵌入参数。该将样品切成5毫米，用苏木精和伊红染色细胞检测。 苏木精，绿绿色和番红蛋白O的三重染色（全部来自Sigma）用于鉴定GAG的存在。 染色部分为使用光学显微镜（Olympus BX51）进行检查。

通过免疫组织化学染色，I型和II型胶原在切片脱蜡和再水化后染色。所有切片在5％牛血清白蛋白和0.3％H 2 O 2中的抗原检测被阻断。大鼠I型胶原蛋白通过将切片在10mM柠檬酸盐缓冲液（pH6）中煮沸10分钟来回收。抗原通过与1mg / ml链霉蛋白酶孵育进行II型胶原的检索（Sigma）和10mg / ml透明质酸酶（Sigma）每个半小时下一个，将切片与4号胶原蛋白I型（兔抗原胶原I型抗体，ABT123，Millipore）或II型胶原（1：100，单克隆小鼠，II-II6B3，DSHB）一起孵育过夜。随后，胶原II型在室温下将切片与GAM-HRP（1:200，P0447，Dako）一起温育一个小时。使用次级生物素化山羊处理Ⅰ型胶原蛋白抗兔抗体1:200（E0432，Dako）在室温下60分钟和第三链霉抗生物素蛋白HRP抗体1：400（室温60分钟）。通过3,30的10分钟转换检测胶原蛋白类型- 二氨基联苯胺溶液（Sigma）。用50％Mayers苏木精复染细胞核。进行同种型对照染色与浓度匹配的鼠IgG1单克隆抗体（Dako那些用于一级抗体或通过不用一级抗体孵育。已经测试

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