葛根提取物可保护由过氧化氢引起的人视网膜色素上皮细胞死亡和膜通透性改变外文翻译资料

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葛根提取物可保护由过氧化氢引起的人视网膜色素上皮细胞死亡和膜通透性改变

摘 要

背景.葛根在亚洲传统医学中用于治疗心血管疾病、腹泻、糖尿病和糖尿病并发症，如糖尿病视网膜病变。视网膜色素上皮细胞的氧化应激与视网膜病变和年龄相关性黄斑变性(AMD)的发病机制有关。在此研究中，我们评估了葛根提取物是否可以防止由氧化应激引起的人视网膜色素上皮细胞的细胞死亡和膜通透性降低。

方法.在人视网膜色素上皮细胞上采用2,7-二氯荧光素二乙酸酯、蛋白质印迹法和免疫组化方法，研究了葛根提取物对过氧化氢-引起的氧化应激的影响。通过测定细胞死亡、活性氧(ROS)生成量、p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性和c-Jun N端激酶(JNK)的磷酸化情况，研究了从葛根提取物中分离的葛根素、黄豆苷元和大豆苷的影响。

结果.我们的结果表明，葛根提取物抑制了活性氧（ROS）的生成，减少了紧密黏连蛋白-1(ZO-1)的断裂，降低了H₂O₂诱导的人视网膜色素上皮细胞的膜通透性。此外，葛根提取物降低了对p38 MAPK和JNK磷酸化的活性抑制。

结论.我们的研究结果表明，葛根提取物有可能通过抑制由氧化应激介导的眼部疾病机制来预防AMD的产生。

1. 背景

视网膜损伤，也被称为视网膜病变，是中老年人视力下降的主要原因，通常是糖尿病、高血压、动脉粥样硬化、血液异常、全身性感染和辐射相关的并发症[1-3]。视网膜色素上皮细胞(RPE)在视网膜内邻近光感受器的发育和维稳中起着重要作用。RPE细胞用于对糖尿病引起的视网膜病变和年龄相关性黄斑变性(AMD)的病理和生理学研究。在RPE细胞上进行候选药物测试，用以开发视网膜病变和AMD的治疗方法[4]。

氧化应激反应在视网膜疾病的发展和加速病变中起着关键作用。它会提高细胞内主要致病成分活性氧(ROS)的水平，从而导致视网膜损伤[5]。ROS还会增加RPE细胞的实际年龄，降低线粒体功能，从而导致细胞损伤[6]。一项最近的研究表明，氧化应激在RPE的形成、退化、功能障碍和与年龄相关的功能丧失中起着特别重要的作用。RPE反复暴露于来自ROS的氧化应激，如过氧化氢（H₂O₂），会导致损伤[9].因此，过氧化氢适用于评估RPE的氧化损伤情况和研究视网膜病变的进展。此外，氧化应激通过紧密连接和粘附连接影响RPE血-视网膜屏障(BRB)的形成[9–11]。紧密连接由跨膜蛋白紧密黏连蛋白-1(ZO-1)和咬合蛋白组成，它们维持BRB的完整性[9,10]。氧化应激破坏紧密连接，增加上皮单层的细胞旁通透性，从而减少咬合蛋白的定位和ZO-1的关联[10,12]。

葛根是众所周知的广泛用于传统医学的一种药物。葛根在东亚地区有广泛种植，用于治疗腹泻、糖尿病和心血管疾病[13–15]。葛根提取物和提取物中的化合物由于其抗氧化、抗缺血、抗癌、抗炎症、抗疲劳和抗视网膜病变作用，已被证明具有治疗特性[14–17]。既往研究表明，葛根提取物通过抑制过氧化氢诱导的氧化应激来抑制中国仓鼠肺成纤维细胞凋亡[18]。在本研究中，我们探讨了葛根提取物及其单独的组成化合物（葛根素、大豆苷元和大豆苷）是否能保护人RPE细胞免受氧化应激。此外，我们还评估了紧密连接的表达和氧化应激诱导的细胞膜通透性的降低，并研究了葛根提取物在RPE细胞中抗氧化作用的机制。

1. 方法

2.1 葛根有效物的提取及单一化合物的分离

葛根收集于韩国嘉泉大学京畿道，并由J.-H. Kim教授鉴定确认。样品凭证（(no. KIOMP041）已存放在韩国东方医学研究所的植物标本室。风干后的葛根材料（4.9kg）利用20L的乙醇浸泡提取3次。将提取液收集并在真空，40℃条件下纯化浓缩成乙醇提取液（665g）。让提取液通过了一系列的色谱程序，使用开放式硅胶、RP-18柱和HPLC，最终分离出三种主要化合物。通过其理化和光谱数据与文献的比较[19]，这些化合物被鉴定为葛根素、大豆苷元和大豆苷（图1）。

图 1.葛根提取物的HPLC色谱和单一化合物的化学结构。标准混合物（a）和葛根提取物（b）在254nm紫外下吸光度检测图。从葛根素中分离到的葛根素、大豆苷元和大豆苷的化学结构（c）。

2.2 细胞培养

人RPE细胞(ARPE-19)购自ATCC(Manassas，VA)，并在含有10%胎牛血清的Hams-12：DMEM培养基（FBS，Gibco，USA）（1：1）中保存。细胞在37°C、5%二氧化碳条件下的加湿培养箱中培养，每48h更换一次培养基。在初次培养细胞达到饱和后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)漂洗，然后与0.5%胰蛋白酶-EDTA(Gibco)在37°C下培养5min。

2.3 细胞活力测定

使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）（Dojindo Molecular Technologies，Japan）测定细胞活力。将RPE细胞（0.5times;104个细胞/孔）接种到含有F12/DMEM和10%胎牛血清的96孔板的每个孔中，然后孵育24h。细胞附着后，用葛根提取物及其单独化合物（葛根素、大豆苷元和大豆苷）在无血清培养基中预处理1h，后用过氧化氢预处理24h。培养完成后，在96孔板的每个孔中加入10mu;L的CCK-8，在5%二氧化碳下的37°C的加湿培养箱中培养2h。利用多光谱微孔板阅读器在450nm波长处测定吸光度（BioTek, Synergy HT, Winooski, VT）。

2.4 生成ROS的测定

利用2,7-二氯荧光素二乙酸酯染色实验测定ROS的产生(DCF-DA, Invitrogen, USA）。用葛根提取物、葛根素、大豆苷元和大豆苷预处理1h后，用过氧化氢(200mu;M)和25mu;M DCF-DA在37°C的加湿5%二氧化碳培养箱中共处理30min。然后用PBS洗涤细胞，并用0.5%胰蛋白酶-EDTA处理。待细胞分离后，用PBS收集细胞。立即利用BD Facscaliburtrade;(San Jose, CA, USA)对ROS的产生情况进行分析。

2.5 渗透性测定

将细胞以0.3times;10⁴细胞/孔的密度接种在Transwell上层小室中(24 wells, PE, 0.4 mu;m pore diameter, Corning Inc., Tewksbury, MA, USA)，用以评价葛根提取物对氧化应激诱导的细胞膜通透性改变的抑制作用。在单层细胞形成后，将培养基替换为无血清的培养基。葛根提取物、葛根素、大豆苷元、大豆苷以及FITC偶联葡聚糖(50kDa;Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)加入Transwell中培养1小时。然后，加入过氧化氢(200mu;M)，在加湿的培养箱中，在37°C、5%二氧化碳的条件下孵育24h。采用Synengytrade;HT多检测酶标仪(BioTek)在激发波长485nm和发射波长525nm下测定FITC。

2.6 免疫组织化学

处理后，用PBS洗涤细胞，用2%多聚甲醛在4°C下固定20min。然后，用PBS洗涤细胞两次，用0.2% TritonX-100的PBS在室温下渗透化处理15min。再次洗涤两次，并在室温下使用阻断缓冲液(含有0.3% TritonX-100和5% 普通血清的PBS)进行阻断。细胞随后在含有ZO-1一抗的阻断缓冲液中4℃温度下培养过夜，培养完成后用PBS缓冲液冲洗三次随后在室温下用二抗阻断缓冲液培养2小时。之后用DAPI处理，使得细胞核可视化。使用荧光显微镜(BX51,Olympus microscope,Japan)获取细胞的免疫荧光图像。

2.7 蛋白印迹分析

处理后，用PBS洗涤细胞，用Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)收集。总蛋白浓度采用BCA蛋白检测试剂盒测定(Pierce Chemical, Grand Island, NY, USA)。煮沸蛋白质样本以备检验分析。样品经10%SDS-PAGE凝胶电泳分离成等量，并转移到硝化纤维素印迹膜(GE Healthcare Life Science, Germany)上。膜用含有0.1%Tween-20(TBST)的tris缓冲盐水洗涤，然后在含有稀释的一抗的TBST中在4°C下培养过夜。然后膜用TBST洗涤三次，用含有稀释的二抗的TBST中在室温下培养2小时。膜进一步用TBST洗涤，并使用 EzWestLumi One（ATTOCorp,Japan）和 LAS3000 (Fujififilm, Tokyo, Japan)进行检测。

2.8 统计分析

数据用多次实验的平均值plusmn;SEM表示。两组数据利用配对型t检验法进行检验，采用Prism5.0软件进行方差分析和Tukey检验(GraphPad 5.0,San Diego,CA,USA)。p值lt;0.05，表示差异有统计学意义。

3.结果

3.1 葛根提取物中葛根素、大豆苷元、大豆苷的HPLC分析。

采用HPLC对葛根素提取物中的葛根素、大豆苷元和大豆苷进行了定量分析。通过与三种标准化合物的保留时间和峰面积的比较，完成了提取物中葛根素、大豆苷元和大豆苷的鉴定和定量测定(图1(b))。通过分析5种浓度的标准溶液来检验HPLC线性准确度(图(a))。葛根素、大豆苷元和大豆苷的校准曲线在给定的浓度范围内显示出良好的线性关系(r²gt;0.9999)(表1)。葛根提取物中葛根素、大

豆苷元和大豆苷的含量分别为188.90、2.73和32.54mg/g(表2)。

表1. 葛根素、大豆苷元、大豆苷的校准数据。

y：组分的峰值面积(mAU)；x：组分的浓度(mu;g/mL)。

表2. 葛根植物提取物中葛根素、大豆苷元和大豆苷的含量。

3.2 葛根提取物对H₂O₂诱导的RPE细胞死亡的影响。

为了检验诱导RPE细胞死亡的H₂O₂浓度，可以使用CCK-8检测方法进行检测，检测结果表明RPE细胞的细胞活力随H₂0₂的浓度提高而降低(图2(a))。300-500mu;M时的过氧化氢在24h时降低了细胞活力指数（%），且与剂量负相关，与对照组相比差异具有统计学意义(***p＜0.001，于对照组相比****p＜0.0001)。接下来，用不同浓度的提取物(0.5-20mu;g/mL)处理细胞24h，用来检测葛根提取物对细胞活力的影响。高剂量的提取物和单一化合物并没有改变细胞活力(图2(b))。为了检测葛根提取物对H₂O₂(300mu;M)诱导的细胞死亡的保护作用，我们用葛根提取物和过氧化氢共同处理细胞。如图2(c)所示，葛根提取物(0.5和1mu;g/mL)显著抑制了H₂O₂诱导的细胞死亡(于对照组相比***p＜0.001；与H₂O₂处理的细胞组相比^#p＜0.05)

图2. (a)H₂O₂诱导的RPE细胞死亡.数据代表了三个独立的实验，用平均值plusmn;SEM表示(n=5)。每组均为***p＜0.001，于对照组相比****p＜0.0001。(b)葛根提取物及其单一化合物对细胞活力的影响。(c)葛根提取物对H₂O₂诱导RPE细胞死亡的抑制作用.数据代表了三个独立的实验，用平均值plusmn;SEM表示(n=6-8)。于对照组相比***p＜0.001；与H₂O₂诱导的细胞活力组相比^##p＜0.01。

3.3 葛根提取物对H₂O₂诱导的细胞内ROS生成的影响

为测定不影响细胞活力的葛根提取物及其单一化合物的浓度，分别用葛根提取物及其单一化合物和200mu;M过氧化氢处理细胞24h。在评估H₂O₂诱导胞内ROS生成之前，需要时间将ROS转化为H₂DCF-DA的表现来进行FACS检测。与预期的一样，用过氧化氢处理30min后，细胞内ROS的生成显著增加（数据未显示）。浓度为200mu;M的过氧化氢对细胞活力没有影响；然而，它显著增加了ROS的生成(图2(a)和3(b))。接下来，我们研究了葛根提取物及其单独成分（葛根素、大豆苷元和大豆苷）对ROS生成的影响。葛根提取物(10mu;g/mL)抑制H₂O₂诱导的细胞内ROS的生成，其水平达到正常对照(图3(c)和3(g))。葛根素、大豆苷元和大豆苷(1mu;M)对H₂O₂诱导的细胞内ROS生成没有任何影响(图3(d)~3(f))。综上所述，葛根提取物可以抑制RPE细胞的氧化损伤。

图3. 葛根提取物对ROS生成的抑制作用.胞内ROS值转化为H_{2 剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料}

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