拟南芥根表皮细胞分化的基因调控网络外文翻译资料

拟南芥根表皮细胞分化的基因调控网络

作者：Angela Bruex¹, Raghunandan M. Kainkaryam², Yana Wieckowski¹, Yeon Hee Kang³, Christine Bernhardt¹, Yang Xia¹, Xiaohua Zheng¹, Jean Y. Wang⁴, Myeong Min Lee³, Philip Benfey⁴, Peter J. Woolf², John Schiefelbein¹*

单位：1 Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan, Ann Arbor, Michigan, United States of America, 2 Department of Chemical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, Michigan, United States of America, 3 Department of Biology, Yonsei University, Seoul, Korea, 4 Department of Biology and IGSP Center for Systems Biology, Duke University, Durham, North Carolina, United States of America

摘要：

拟南芥的根表皮为研究细胞命运和分化的分子基础提供了一个特殊的模型。为了获得根表皮细胞分化的系统级视图，我们使用全基因组转录组方法来定义和组织大量基因，形成转录调控网络。我们利用只产生两种表皮细胞类型中一种的细胞命运突变体，结合荧光激活细胞分类技术来优先分析根表皮转录组，鉴定出了1582个在根毛或非毛细胞类型中差异表达的基因，包括一组208个“核心”根表皮基因。通过使用17种不同的根表皮突变体和2种激素处理来扰乱系统，并评估对每个基因转录物积累的影响，从而将核心基因组织成一个网络。此外，来自发育时间序列数据组的时态基因表达信息和来自贝叶斯建模方法的预测基因关联被用于帮助在网络中定位基因。此外，对网络中可能的bHLH调节基因（包括MYC1、bHLH54、bHLH66和bHLH82）的详细功能分析表明，bHLH蛋白的三个不同亚家族以阶段特异性方式参与根表皮发育。结合遗传、基因组和计算分析，为根表皮转录网络的组成、结构和逻辑提供了一个新的视角，并展示了一种全面的系统方法在解剖复杂调控网络方面的实用性。

1引言

分子生物学研究的当前目标是理解复杂基因调控网络的组织和逻辑。为此，基因组规模的方法已被用于生成有关基因在时间和空间上的身份鉴定和功能表达的大型数据集。尽管人们对使用表达数据组来理解基因途径的转录调控非常感兴趣^[1,2]，但目前我们对基因在复杂网络中的组织方式和协调功能只有初步了解，以至于产生许多生物过程固有的灵活性和稳定性。

由于拟南芥根表皮发育简单，分子遗传资源丰富，为研究基因网络提供了一个潜在的有用模型^[3,4,5]。根表皮由一层排列成行（或元件）的细胞组成，其整个发育历史已被定义为从胚胎起源到成熟细胞类型^[6,7,8]（图1）。根分生组织区域的连续横向分裂产生新的表皮细胞，随着年龄的增长，这些细胞逐渐分化，最终成为根毛细胞或毛细胞。这两种细胞类型以位置依赖的模式出现，根毛细胞在底层皮质细胞（H细胞位置）和非毛细胞之间的细胞间隙上发育，非毛细胞在单个皮质细胞（N细胞位置）上发育，这意味着位置线索在细胞命运决定中起作用^[9,10]（图1），除了根毛的形成（通过极化单细胞（尖端）生长延伸的长管状延伸）不同之外，根毛细胞和非毛细胞在细胞分裂率^[11]、细胞长度^[9,12]、细胞质密度^[9,10]、空泡化率^[10]、细胞表面特征^[9,13]和染色质组织^[14]方面表现出差异，这表明这些细胞类型经历了不同的细胞分化程序。

通过使用正向和反向遗传方法确定了大量影响根表皮细胞分化的基因^[5,15]（图1）。TRANSPARENT TESTA GLABRA (TTG), GLABRA3 (GL3), ENHANCER OF GLABRA3 (EGL3), WEREWOLF (WER)和MYB23这五个基因编码转录因子，这些转录因子在早期阶段指定非毛细胞的命运，因为这些突变（单独或组合）导致根毛细胞代替非毛细胞（“毛”突变体）的形成^{[10,12,16,17,18]}。CAPRICE（CPC）、TRIPTYCHON（TRY）和ENHANCER OF TRY AND CPC （ETC1）这三个基因有助于确定毛细胞的命运，它们中的突变（单独或组合）导致非毛细胞代替毛细胞（“无毛”突变体）^[19,20,21]。目前的模型表明，TTG（一种小WD重复蛋白^[22]）、GL3和EGL3（bHLH转录因子^[23,24,25]）以及WER和MYB23（MYB型转录因子^[17,18]）在N细胞的中央转录复合物中起作用，以促进非毛细胞的命运。该中心复合物还通过促进CPC、TRY和ETC1的转录来介导侧向抑制，这是一种小的单重复MYB蛋白，能够移动到相邻的H细胞，并抑制WER/MYB23-GL3/EGL3-TTG复合物的形成^{[19,20,21,26,27,28,29,30,31,32,33]}。此外，中央复合体抑制GL3/EGL3 bHLH基因的表达，因此，bHLH蛋白被认为是从H细胞转移到N细胞^[24]。建议通过扰乱的LRR受体样激酶作用的位置线索启动适当的毛/非毛细胞类型模式，以影响H和N细胞位置中转录复合物的相对丰度^[34,35,36]。

早期作用的根表皮转录因子被认为控制许多编码转录调节因子、信号分子、酶和结构蛋白的基因的表达，这些基因负责细胞形态特异性发生和生化变化。其中一个基因GLABRA2（GL2）编码非毛细胞分化所需的同源域亮氨酸拉链（HD-Zip）转录因子蛋白^[37]。ROOT HAIR DEFECTIVE6 （RHD6）基因可能受到GL2的负调控，它编码一种碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子，与相关的bHLH蛋白（RSL1）一起，是根毛细胞分化所必需的^[39,40,41]。表皮细胞中后期的形态变化受负责细胞壁生物合成、细胞骨架活动和细胞外物质（如COW1、COBL9、IRE1、LRX1和MRH蛋白质）的产生/运输的蛋白质的影响^[5,15]（图1）。根毛细胞分化也受到植物激素生长素和乙烯的影响，从而促进毛发的形成和形态发生。因此确切的分子基础尚不清楚^[40,42,43]。

为了提高对控制根表皮分化的基因网络的组成、组织和功能的理解，我们使用根表皮突变体和植物激素处理进行了大规模比较转录组分析。我们推断得出，用特定的突变和处理扰乱网络将引发转录组发生变化，这些变化可用于解剖网络和确定网络中成员基因的相对位置。此外，我们将这种方法与来自发育时序数据组的时态基因表达情况以及既定的新识别转录因子基因的分子遗传学分析相结合。总之，这些结果为控制根表皮发育的基因调控网络提供了新的见解，包括组成基因的种类、它们组织成不同的转录分支，以及它们对外源因素的响应。这些结果为未来的研究提供了基因资源，并证明了基于突变的转录组分析在解剖调控网络结构方面的实用性。

2结果

2.1根表皮细胞分化途径中基因的鉴定

作为建立根表皮发育基因调控网络的第一步，我们定义了一组参与这一过程的基因。鉴于WER/MYB23、GL3/EGL3、TTG和CPC/TRY是已知最早的根毛/非毛细胞命运转录调节因子，我们对这些突变的纯合株系进行了基于微阵列的比较，以确定其转录控制下的基因，能够优先在一种或另一种细胞类型中表达（图2A）。其中三个突变系产生过多的根毛细胞（“毛细胞系”；wer myb23、gl3 egl3和ttg），一个突变系只产生非毛细胞（“无毛系”；cpc try）（图S1C；表S1）。我们推断，通过消除与表皮发育无关的过程中的影响而导致的潜在假阳性，使用多个独立的毛状突变系将最大限度地提高我们分析的稳健性。

为了集中观察发育中的根表皮中的基因表达，将WER::GFP转基因^[17]整合到四种突变体中，并通过荧光激活细胞分选（FACS）方法获得WER::GFP表达细胞及其RNA[44,45]。为此选择WER:：GFP标记是有以下3个原因：（1） WER位于表皮规格层次结构的顶端，其空间表达不受网络中其他成分变化的显著影响（图S2）;（2）WER::GFP在根表皮细胞分化的所有阶段都有表达，从最初的细胞到最终的分化区^[17];（3）WER::GFP在分化的毛细胞和非毛细胞类型中均表达，尽管它优先在非毛细胞中表达^[17]（图S2）。

我们使用ATH1-Affymetrix阵列对于每一个四行（wer myb23，gl3 egl3,ttg,和cpc try）在两个不同设施（密歇根大学和杜克大学）中的每一个进行了三次微阵列实验，以最大化恢复基因型依赖的转录差异（每个基因型有6个生物基因复制，共有24个微阵列）。在两次比较中，至少有一次（密歇根大学或杜克大学；图2A；表S2），共有1582个基因在有毛突变系和无毛突变系之间的转录丰度（qlt;0.01）存在显著差异。这些基因编码的蛋白质在与根表皮活动一致的基因本体（GO）类别中过度表达（plt;0.05），包括细胞壁生物合成、细胞分泌和扩张的一般类别，以及根毛细胞分化、表皮细胞命运选择、和根毛伸长（表S3）

为了观察受这些转录调节因子强烈影响的一些较小的基因，我们对1582个基因进行了二级筛选，在杜克大学和密歇根大学的数据中，在无毛系（cpc-try）和三个有毛系（wer-myb23，gl3-egl3，ttg）之间的每次单独比较中，要求转录水平至少发生2.0倍的变化（总共六次比较）。我们鉴定了208个符合这些标准的基因（称为“核心根表皮基因”）；包括154个基因的转录本在三个有毛系中的每一个中都较为丰富（称为“根毛基因”），还有54个基因的转录本在cpc-try系中较为丰富（称为“非根毛基因”）（图2；表S4）。

来自几个独立（非微阵列）来源的数据验证了这个根表皮基因集。首先，这208个基因集中包括所有六个基因，这些基因之前被证明受根表皮中一个或多个WER/MYB23、GL3/EGL3、TTG或CPC/TRY转录因子的转录调控：GL2[12,46]、ETC1[47,48]、RHD6[41]、PRP3[49]、TTG2[50]和EXP7[51]。此外，该列表还包括通过突变或错误表达的研究中发现在功能上与根表皮发育过程相关的八个额外基因（COBL9、COW1、IRE1、LRX1、MRH1、MRH2、MRH3、MRH6；表S4）。此外，GO分析表明，与根表皮相关类别相关的基因，如“根毛细胞分化”、“细胞顶端生长”、“根表皮细胞分化”和“毛细胞分化”在208个基因集中显著差异（plt;0.05）（图2B）。

2.2根表皮途径中新转录因子基因的分析

通过GO分析和拟南芥基因组信息，预测208个核心根表皮基因中的14个编码转录因子（表S4；图2A）。在进行该分析时，已知这14个基因中只有5个与根表皮发育有关（TRY、ETC1、GL2、TTG2和RHD6；表S4）。在其他九种基因中，有四种编码bHLH转录

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