黄花石蒜EST-SSR标记的鉴定、验证、跨种转移及其在石蒜属植物遗传评价中的应用外文翻译资料

Jiang et al. BMC Plant Biology (2020) 20:522

https://doi.org/10.1186/s12870-020-02727-3

EST-SSR标记的鉴定、验证和跨物

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黄花石蒜EST-SSR标记的鉴定、验证、跨种转移及其在石蒜属植物遗传评价中的应用

Yumei Jiang^1,2, Sheng Xu^1,2, Rong Wang^1,2, Jiayu Zhou^1,2, Jian Dou¹, Qian Yin¹ and Ren Wang^1,2*

摘要

背景:石蒜属包括许多重要的观赏和药用植物。多倍体化和杂交被认为是该属物种形成的模式，意味着巨大的遗传多样性。然而，由于缺乏有效的分子标记，限制了对该属植物的遗传分析。

结果:本研究利用金丝菊转录组序列进行EST-SSR标记的挖掘，成功设计出839对非冗余EST-SSR引物。随机选取60对进行验证，其中44对可以放大预期尺寸的产品。对60对引物在石蒜属植物(L. radiata Hreb)、L. sprengeri Comes ex Baker、L. chinensis Traub和L.安徽石蒜属植物(L. anhuiensis)中的跨种转移性进行了评价，其中38 - 77%的引物能够扩增出在这些石蒜属植物中的产物。分别选择20个和10个扩增产物进行金乳杆菌和辐射乳杆菌的测序验证。所有产品均验证为预期的SSRs。此外，还选择了15个ssr标记，其中10个已验证的ssr标记和5个未验证的ssr标记，对7个放线菌系的遗传多样性进行了评价。其中不育系3个，可育系3个，可育系的后代代表1个系。UPGMA (Unweighted pair group with arithmetic mean analysis)分析结果表明，金羊草与辐射羊草系分离出外群，7个辐射羊草系聚为2个群，与它们的育性一致。有趣的是，即使有34个个体代表7个辐射型L. radiata株系的树状图也几乎与生育能力一致。

结论:本研究为石蒜属植物遗传分析提供了839个潜在的非冗余SSR标记，具有较高的扩增率、可转移性和有效性，为石蒜属植物的遗传分析和育种规划提供了依据。

关键词:EST-SSR，分子标记，遗传分析，多态性，石蒜

背景

属石蒜属,石蒜科家族的一员,包含30个物种分布世界各地。在中国有15种1变种，其中radiata和aurea是分布最广的两种。石蒜属植物是一种具有独特的石蒜科生物碱的药用植物，具有抗病毒、抗肿瘤、抑制乙酰胆碱酯酶等多种药理作用[1-4]。此外，由于花的颜色和形状多种多样，有些还具有香味[5]，它们是非常受欢迎的观赏植物。因此，对石蒜品种的需求一直在增加。

多倍体化和杂交被认为是该属的物种形成模式[6-9]。石蒜的核型研究已被广泛开展，已发现许多核型，如2n = 12、13、14、15、16、17、18、19、21、22、24、25、27、30、32、33、44，分别对应二倍体、非整倍体、三倍体和四倍体的状态[7,8,10 - 13]。石蒜的基本染色体数在x = 6 ~ x = 11[5]之间变化，以x = 8和x = 11为主。如L. chinensis、L. anhuiensis和L. lengthuba是x = 8的种，L. radiata、L. sprengeri和L. sanguinea是x = 11的种[6,8]。此外，有些种是由x = 11的两个种间杂交、x = 8的种间杂交和x = 11的种间杂交而来的。例如，L. straminea是L. radiata var. pumila和L. chinensis的杂交品种[6,14]。流式细胞术分析表明，x = 11和x = 8的物种基因组大小差异较大，且在L. radiata[15]株系间存在均匀差异。据此，石蒜属植物具有较高的遗传多样性。因此，对石蒜种质资源进行遗传分析，不仅对揭示石蒜种质资源的起源，而且对优质种质资源的有效保存和开发具有重要意义。

分子标记在遗传多样性分析中已被证明是有效的。许多基于dna的分子标记被用于遗传多样性分析，如RFLPs、rapd和SSRs[16,17]，其中SSRs因其共显性遗传、良好的重现性和成本效益而受到广泛应用[18,19]。SSRs是由两类序列资源发展而来的。一种来自基因组DNA，称为基因组SSRs，另一种来自表达序列标签(est)，称为EST-SSRs或基因SSRs。与基因组SSRs相比，EST-SSRs更容易在近缘物种间转移。目前，越来越多的物种利用下一代测序技术进行了序列测定，GenBank中有大量可供参考的est序列。因此，开发EST-SSR标记将为许多物种，特别是那些基因组研究进展顺利的物种提供方便

缓慢。例如，从姜黄(Curcuma alismatifolia[21])、铁皮石斛(Dendrobium officinale[22])、沙柳(Salix psammophila[23])和刺槐(Robinia pseudoacacia[24])的转录组数据中开发了EST-SSR标记。

在石蒜中，对L.经度、L. aurea和L. sprengeri进行了转录组测序[25-28]，获得了大量含有SSRs的序列，为开发EST-SSRs提供了方便和经济的机会。然而，从纵向L.[25]和spren- geri[29]中开发出的EST-SSRs只有27个，从辐射L. radiata中开发出的基因组SSRs只有27个，以及L. aurea和辐射L.之间的杂种[30,31]。因此，开发更多的石蒜属ssr分子标记是开展石蒜种质资源保护和育种研究的需要。此前，我们利用短序列测序技术(Illumina)对茉莉酸甲酯(MJ)处理下的金黄色葡萄球菌(L. aurea)幼苗的转录组进行测序，组装了59643个unigenes[27]。在本研究中，基于这些数据进行EST-SSR挖掘。本研究的主要目的是为石蒜属植物的遗传分析提供大量的非冗余SSR标记，为石蒜属优质种质资源的开发和利用提供依据。

结果

EST-SSRs的开发与表征

在金黄色葡萄球菌[27]转录组序列组装的59643个unigenes中，MISA程序共检测到4637个SSRs。为了消除对同一基因的替代转录本的冗余SSRs，采用BioE- dit进行序列比对。最后，共设计引物839条，其中三核苷酸重复623次，二核苷酸重复147次，四核苷酸重复9次，五核苷酸重复13次，六核苷酸重复47次。如表1所示，检测到的SSRs主要类型为三核苷酸重复和二核苷酸重复，这与之前使用454焦磷酸测序[26]分析的报告一致。我们的数据显示，三核苷酸重复序列占74.25%，其中(AAG)n/(CTT) n是最常见的类型。二核苷酸重复占17.52%，其中(AG)n/(CT) n重复最常见，(GC)n/(GC) n最不常见。EST-SSR序列中，28条EST包含2个SSR位点，4条EST包含3个SSR位点，1条EST包含8个SSR位点。利用Primer3软件(http://bioinfo.ut)设计共839对ssr特异性引物。ee/ primer3/)，表示796个unigenes(表S1)。

验证EST-SSRs

为了验证所设计的引物的有效性，我们随机选取60对引物对金黄色葡萄球菌进行检测，其中9个双核苷酸重复，46个三核苷酸重复，1个四核苷酸重复，2个五核苷酸重复

表1金黄色葡萄球菌二至六核苷酸重复基序的频率