石蒜花发育过程中的次级代谢产物（酚酸、类胡萝卜素、花青素和加兰他敏）和初级代谢产物（碳水化合物、氨基酸和有机酸）概述外文翻译资料

石蒜花发育过程中的次级代谢产物（酚酸、类胡萝卜素、花青素和加兰他敏）和初级代谢产物（碳水化合物、氨基酸和有机酸）概述

原文作者：Chang Ha Park ^1,dagger;, Hyeon Ji Yeo ^1,dagger;, Ye Jin Kim ², Bao Van Nguyen ³, Ye Eun Park ¹, Ramaraj Sathasivam ¹, Jae Kwang Kim ^2,* and Sang Un Park ^1,3,*

单位：Department of Crop Science, Chungnam National University, 99 Daehak-ro, Yuseong-gu, Daejeon 34134, Korea; Division of Life Sciences, College of Life Sciences and ioengineering, Incheon National University, Yeonsugu, Incheon 22012, Korea; Department of Smart Agriculture Systems, Chungnam National University, 99 Daehak-ro, Yuseong-gu, Daejeon 34134, Korea.

摘要：本研究旨在通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）和气相色谱-飞行时间质谱（gas chromatography time-of-flight mass spectrometry，GC-TOFMS）分析石蒜花发育过程中初级和次级代谢产物的变化。结果表明，石蒜花中含有7种类胡萝卜素、7种酚酸、3种花青素和加兰他敏。大多数次生代谢物水平随着花的发育阶段而逐渐降低。通过GC-TOFMS对总共51种代谢物包括胺、糖、糖中间体、糖醇、氨基酸、有机酸、酚酸和三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环中间产物，进行了鉴定和定量。在亲水化合物中，大多数氨基酸在花发育过程中增加；相反，TCA循环中间产物和糖减少。特别是，代表主要细胞间和细胞内氮载体的谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸和天冬氨酸与其他氨基酸呈正相关，与TCA循环中间产物呈负相关。此外，还对51种亲水化合物的定量数据进行了偏最小二乘法判别分析（partial least-squares discriminant Analyses，PLS-DA），以评估石蒜花1至4期代谢产物的显著差异。因此，本研究将为通过生物化学方法了解石蒜花发育过程中的初级代谢产物和次级代谢产物奠定基础。

关键词：石蒜；花发育；代谢谱分析；初级代谢产物；次生代谢产物

1. 引言

石蒜属（Lycoris）植物属于石蒜科，原产于韩国、中国和日本等东亚国家，主要栖息于潮湿、温暖的温带林地^[1]。其中石蒜在医学和装饰上很重要，其花可用于装饰，而鳞茎能产生具有各种药用特性的生物碱^[2]。特别是加兰他敏，它是一种从石蒜科植物的鳞茎或花朵中分离出来的三级生物碱，可用于治疗轻度至中度阿尔茨海默病。此外，在这种植物中发现的生物碱有益处，如抗炎和细胞毒性作用^[3]，抗疟疾作用^[4]，以及抑制非肥胖糖尿病患者抗胰岛素抗体的能力^[5]。

花色是观赏植物的一个基本特征。花色是由包括花青素、beta;-半乳糖和类胡萝卜素在内的色素积累程度决定的。除了增加商业价值外，花色还有助于吸引动物和昆虫等传粉者，抵御紫外线辐射，并且能够作为微生物和植物之间的关键信号^[6–8]。

类胡萝卜素属于萜类，参与植物黄色、红色或橙色的颜色形成^[9,10]。在非绿色组织如种子、果实和花朵中，类胡萝卜素在染色质中产生，导致组织呈现鲜艳的颜色；然而，在绿色组织中，这些色素在光合作用中发挥重要作用，包括光系统组装、采光和光保护功能^[10–12]。此外，非绿色组织中的类胡萝卜素含量因植物种类而异，而大多数植物的绿色组织表现出类似的类胡萝卜素特征^[12–14]。

花青素属于类黄酮类，是一种天然色素，可赋予花朵多种颜色，如紫色、蓝色、橙色和红色。有六种常见的花青素（即花青素、飞燕草苷、锦葵色素、天竺葵素、牡丹素和矮牵牛素）^[8,15-17]，花青素是植物中主要的花青素苷元，与红紫色的着色有关^[18]。Chun等人^[19]之前报道过，通过鉴定花青素3-二葡萄糖苷、花青素3-桑布甙和花青素3-葡萄糖苷的存在，花青素是石蒜花中的主要花青素。

Ma等人^[20]提出了花瓣发育和衰老的模型，他们将花瓣发育分为三个阶段，即细胞分裂阶段、细胞扩张阶段和细胞收缩/死亡阶段。简言之，当花瓣细胞停止分裂并进入细胞扩张阶段时，花瓣衰老可能开始，并且这种衰老可能受到多种因素的协同调节，例如表观遗传修饰物、激素、激酶、其他酶、微RNA（micro RNAs，miRNAs）、糖水平和转录因子^[20]。在这些因素中，内源糖水平在开花和衰老期间发生改变，蔗糖供应通过改变激素平衡促进开花和延缓衰老^[21]。因此，代谢物分析可以提供有益的信息，以扩展和补充以前的研究。本研究旨在根据石花发育蒜的四个不同阶段（图1）提供有关代谢物变化的有价值的信息，并确定不同代谢物之间的可能关系，包括初级代谢物（胺、糖、糖中间体、糖醇、氨基酸、有机酸和三羧酸（TCA）循环中间体）和次级代谢物（酚类、类胡萝卜素和生物碱）。

图1 石蒜花发育的四个阶段

（A）花芽（第1阶段）；（B）部分开放的花（第2阶段）；（C）完全开放的花（第3阶段）；（D）衰老的花（第4阶段）。

2.材料和方法

2.1. 植物材料

2019年10月，从中南国立大学的实验场地采集了石蒜花第1阶段（花芽）、第2阶段（部分开放的花）、第3阶段（完全开放的花）和第4阶段（衰老的花）的三组生物学重复，并用液氮快速冷冻（minus;196 ℃）。每组生物学重复有10朵花，这些花在四个不同的发育阶段收获。将收获的花朵在室温下冻干minus;80 ℃搅拌72 h，再使用研钵和杵研磨花朵样品，以进行进一步的分析。

2.2. 类胡萝卜素HPLC分析

类胡萝卜素HPLC分析采用之前报道的方法进行^[9]。使用0.1%（w/v）的抗坏血酸在乙醇（3 mL）中提取不同发育阶段的石蒜花干燥粉末（0.02 g），并旋转20 s。将提取物置于设定为85 ℃的水浴中5分钟。为皂化，向提取物中添加氢氧化钾（120 micro;L，80% w/v），并将提取物置于85 ℃的水浴中。随后立即将提取物转移至冰上，并向每个试管中加入冷水（1.5 mL）。反式-beta;-载脂蛋白-8rsquo;-胡萝卜素（0.2 mL，25 micro;g/mL）用作内标物。使用己烷（1.5 mL）分层，并将每个样品上方的己烷层转移到新管中。这一步重复两次。将收集的上清液用氮气干燥，并将其溶解在0:50（v/v）的二氯甲烷/甲醇（0.25 mL）中。用于HPLC分析的分析设备和条件如Park等人^[9]所述。使用我们之前文库鉴定的类胡萝卜素，并通过结合使用保留时间和与反式-beta;-载脂蛋白-8rsquo;-胡萝卜素共洗脱，参考相应的校准曲线进行定量。叶黄素、玉米黄质、beta;-隐黄质、13Z-beta;-胡萝卜素、alpha;-胡萝卜素、beta;-胡萝卜素和9Z-beta;-胡萝卜素的线性方程分别为y = 0.1847 x 0.1214，y = 0.4712 x minus; 0.0284，y = 0.3329 x 0.0338，y = 0.3361 x minus; 0.0220，y = 0.5479 x minus; 0.0805、y = 0.2154 x 0.1814和y = 0.4284 x 0.0339。

2.3. 酚酸HPLC分析

酚酸分析采用之前报道的方法进行^[22]。使用80%的甲醇（1 mL）提取不同发育阶段的石蒜花干燥粉末（0.1 g），并在25 ℃下超声处理30 min。在15000times;g离心15 min后，将上清液转移到新的试管中。使用样品残留物重复该提取程序两次。HPLC分析系统由OptimaPak C18柱（250times;4.6 mm，5 micro;m；韩国大田RStech公司）、NS-4000 HPLC系统、NS-6000自动取样器（韩国大田Futecs公司）、脱气器和UV-Vis检测器组成，用于分离和量化样品提取物中的多酚化合物。酚酸分析的分析条件基于我们之前的研究^[22]。通过与没食子酸、4-羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸和对香豆酸标准化学品（韩国永仁的Sigma-Aldrich）的保留时间进行比较，使用加标试验确定酚酸，并使用相应的校准曲线进行量化。没食子酸、4-羟基苯甲酸、绿原酸、咖啡酸和对香豆酸的线性方程分别为y = 32.896 x minus; 26.174，y = 16.421 x 100.8，y = 17.795 x minus; 70.351，y = 39.983 x minus; 65.708和y = 60.933 x 266.03。

2.4. 加兰他敏HPLC分析

加兰他敏HPLC分析采用之前报道的方法进行^[2]，但略有修改。用80%的甲醇（1 mL）提取处于不同发育阶段的石蒜花粉末（0.1 g），然后在25 ℃下超声处理30 min。在15000times;g离心15 min后，将上清液转移到新的试管中。使用样品残留物重复该程序两次。收集的溶液用氮气干燥并溶解在甲醇中。使用OptimaPak C18柱、NS-4000高效液相色谱系统、NS-6000自动取样器、脱气器和紫外可见检测器分离加兰他敏。根据我们之前的研究^[2]，对加兰他敏含量的分析条件、鉴定和量化进行了估计。加兰他敏线的性方程为y = 12.770 x minus; 12.500。

2.5. 花青素HPLC分析

花青素HPLC分析是根据我们之前的研究中描述的程序进行的，该研究报告了花青素3-二葡萄糖苷（cyanidin 3-diglucoside，C3DG）、花青素3-桑布苷（cyanidin 3-sambubioside, C3S）和花青素-3-葡萄糖苷（cyanindin-3-glucoside，C3G）的质谱，石蒜花中的C3DG是m/z 318 [M H] 、287 MSⁿ，C3S是m/z 581[M H] 、287 MSⁿ，C3G是m/z 449[M H] 、287 MS^{n [19]}。使用1.5 mL水/甲醇（95:5，v/v）提取处于不同发育阶段的石蒜花粉末（0.1 g），然后在25 ℃下轻度超声处理20 min。在8000 rpm下离心30 min后，通过聚四氟乙烯（Polytetrafluorethylene，PTFE）亲水注射器过滤上清液。HPLC系统（美国加利福尼亚州帕洛阿尔托市安捷伦科技公司）包括Synergy 4-micro;m Polar RP 80A柱（250times;4.6 mm内径；美国加利福尼亚州托伦斯市Phenomenex）和安全防护药盒（AQ C18，4times;3 mm内径；美国加利福尼亚州托伦斯市Phenomenex）用于分离花青素。花青素含量的分析条件、鉴定和量化是在我们之前研究的基础上进行的^[19]。C3G的线性方程为y = 6.042 x minus; 4.204，C3DG和C3S的浓度计算为C3G的当量。

2.6. QRT-PCR分析

QRT-PCR采用之前报道的方法进行^[23]。通过Plant RNA Mini Kit（台湾汐止 Geneaid）提取不同发育阶段石蒜花的总RNA，然后用ReverTraAce^reg;Kit（日本大阪TOYOBO）合成互补DNA（cDNA）。本研究使用了先前研究中的基因特异性引物。用于GC-TOFMS分析的分析设备和条件如Park等人^[23]所述。苯丙烷和加兰他敏生物合成基因的表达用的是2^{minus;∆∆Ct}法。

2.7. 碳水化合物、氨基酸、有机酸和酚酸的GC-TOFMS分析

提取和分析用的是我们之前报告的方法^[24]。用1 mL水/氯仿/甲醇（1:1:2.5 v/v/v）混合物提取处于不同发育阶段的石蒜花的干燥粉末（0.01 g），添加60 micro;L阿多尼托（0.2 g L^minus;1）作为内部标准品添加。提取物在Eppendorf Thermom混合器^reg;Comfort中以1300 rpm的振动频率37 ℃下混合30 min，再以15000times;g离心10 min。将极性相（800 micro;L）转移到新管中，然后添加400 micro;L蒸馏水。然后将该混合物在15000times;g下离心5

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