大鼠和小鼠少突胶质细胞前体细胞的分离和培养外文翻译资料

大鼠和小鼠少突胶质细胞前体细胞的分离和培养

原文作者： Ying Chen¹, Veerakumar Balasubramaniyan¹, Jie Peng², Edward C Hurlock¹, Michelle Tallquist³, Jianrong Li² amp; Q Richard Lu^1,3

单位：¹德克萨斯大学西南医学中心发育生物学系和肯特·沃尔德雷普基金会神经生长和再生基础神经科学研究中心，达拉斯，美国德克萨斯州75390。²美国德州农工大学兽医和生物医学科学学院兽医综合生物科学系，德克萨斯州77843。³德克萨斯大学西南医学中心分子生物学系，达拉斯，美国德克萨斯州75390。

摘要：分离少突胶质前体细胞(OPCs)的技术为研究其分化、特性及髓鞘修复潜能提供了有力的保障。虽然关于从大鼠中枢神经系统中分离OPCs已有很多实用的知识，但由于难以获得足量纯化的OPCs，小鼠OPCs的制备和维持一直是一个挑战。在此，我们描述了制备高富集的大鼠OPCs和近乎同种的小鼠OPCs的方法。制备小鼠OPCs的方法主要是利用分子遗传工具，从皮质神经祖细胞即被称为“寡球”的克隆聚集体产生OPCs，分离出的OPCs可进一步分化为少突胶质细胞。总而言之，我们描述了在体外制备和维持大鼠以及小鼠高富集OPCs的简单有效的方法。分离和培养大量的、同种的啮齿动物的OPCs，将极大的促进OPC谱系进展的研究及其在髓鞘损伤后修复中的应用。

关键词：少突胶质细胞，少突胶质前体细胞

引言

少突胶质细胞作为中枢神经系统(CNS)的髓鞘胶质细胞，在促进神经元动作电位的快速传导^[1]和支持轴突存活^[2]中发挥着至关重要的作用。少突胶质细胞由OPCs产生，在胚胎发育后期，OPCs会在整个中枢神经系统中增殖和迁移，然后分化为成熟的有髓鞘包裹的少突胶质细胞^[3,4]。少突胶质细胞的几个不同的成熟阶段在体外已被确认为少突胶质细胞谱系的细胞^[3,5]，包括特征位表达祖细胞标记物的正在增殖的OPCs，如具有双极或三极形态的血小板衍生生长因子受体(PDGFaR)，中间表达具有多极形态的O4抗体识别标记物的未成熟的少突胶质细胞，最后是成熟的表达髓鞘特异性蛋白，如髓鞘碱性蛋白的成髓鞘的少突胶质细胞，当少突胶质细胞前体细胞移植到低髓鞘宿主的大脑中时，可以迁移极长的距离，并产生大量成熟的少突胶质细胞^[6,7]以及轴突的髓鞘^[8]。分离和纯化可行数量OPCs的简单办法不仅有助于更好地了解少突胶质细胞的发育、功能及与轴突-少突胶质细胞的相互作用，而且为髓鞘修复研究提供了不可或缺的手段。从中枢神经系统中分离大鼠OPCs的部分方法已被阐述，如免疫抗体包被筛选法^[5,9,10]，利用细胞表面特异性抗原^[7,8,12]的荧光活化细胞分选(FACS) ^[5,11]，利用剪切力将大鼠OPCs从混合胶质培养的星形胶质细胞中分离出来的差速梯度离心法或一种基于胶质细胞粘附特性的震荡方法^[13,14]，

与大鼠OPCs相比，小鼠OPCs被证实更难以分离。小鼠OPC与大鼠OPC并不共享所有的细胞表面抗原，如A2B5^[15]。从而阻碍了免疫抗体包被筛选法和荧光活化细胞分选(FACS)等分离大鼠OPC方法的应用。此外，小鼠OPCs在体外混合胶质培养中具有分化倾向。用震荡法从星形胶质细胞种分离也比较困难。最重要的是，随着许多转基因和敲除研究在小鼠身上进行，建立从小鼠中枢神经系统（CNS）组织中分离和纯化大量OPCs的简便方法变得愈加重要。多能神经祖细胞可以产生谱系受限的少突胶质细胞的事实^[16,17]为从神经祖细胞产生OPCs提供了一条新的途径。一些研究描述了从不同物种(如狗和啮齿动物)的神经祖/干细胞中产生自我更新的OPC的方法^[18-21]。因为PDGFalpha;R的表达可在CNS4中识别OPC^[4,22]，我们利用PDGFalpha;R-GFP基因敲入小鼠^[23]，其中核定位的绿色荧光蛋白(GFP)被敲入PDGFalpha;R基因座，来识别OPC。所以，通过追踪GFP的表达，可以监测不同培养条件下小鼠皮质祖细胞PDGFalpha;R OPCs的形成和分离。因此，我们在此描述了制备大鼠或小鼠大量富集OPCs的简单技术流程。这些方法允许使用选择性来分离程序分离大鼠OPCs并进行修饰^[24]，并且使用胚胎多能皮层祖细胞从神经球形成“寡球”来产生大量小鼠OPCs。通过以下方法分离的OPCs可以诱导分化为未成熟的少突胶质细胞，再分化为成熟的少突胶质细胞。这些方法将会促进OPC在体外的应用，如解决各种分子对OPC分化和轴突-少突胶质细胞相互作用的影响等问题。

材料：

试剂：

·C57B6/J(杰克逊实验室)和PDGFalpha;R-GFP基因敲入小鼠^[23]

！警告 涉及活体动物的实验必须符合国家和机构的规定。

·斯普拉格-道利大鼠(哈兰工业公司)!警告涉及活体动物的实验必须符合国家和机构的规定

·杜尔贝克改进的Eagle的介质 (DMEM; Invitrogen/Gibco 11960)不含l -谷氨酰胺和丙酮酸钠

·100 x N2营养剂(Invitrogen 17502048)

·DMEM / F12((Invitrogen/ Gibco 11330 - 032)

·胎牛血清(FBS; Hyclone SH300700)

·L-谷酰胺(sigma;G8540)

·丙酮酸钠(Sigma P2256)

·牛血清白蛋白(BSA; Sigma A9647)

·转铁蛋白(Sigma T2252)

·胰岛素(SigmaI6634)

·亚硒酸钠(Sigma S5261)

·D-生物素（D-Biotin）

·皮质醇(Sigma H0888)

·人血小板衍生引子-AA (Peprotech 100-13A)(PDGFAA)

·基础成纤维细胞生长因子 (Peprotech 100-18B)(FGF)

·人重组表皮生长因子; EGF；Peprotech 100-15)

·纤毛神经营养因子; (CNTF; Peprotech 450-50)

·N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC; Sigma A-8199)

·三碘甲状腺氨酸(Sigma, T-2752)

·多聚-D-赖氨酸氢溴酸盐(Sigma P0899)

·多聚赖氨酸(Sigma P0899)

·圆形盖玻片(直径12mm) (Carolina Biological; 63-3009)

·青霉素、链霉素(Invitrogen 15140)

·Hanks平衡盐溶液(HBSS; Invitrogen 14025)

·DNase I (Sigma D5025)

·胰蛋白酶:l -1-tosylamido-2-苯乙基氯甲基酮(TPCK)处理的胰蛋白酶(Sigma T1426)

·台盼蓝(0.04% (w/v)， Sigma T8154)

·苯甲基磺酰氟(Sigma P7626-5G)

·Dulbecco的不含Mg和Ca的磷酸盐缓冲盐水(DPBS) (Invitrogen 14190-144)

设备

·湿润的组织培养箱(37℃，5% CO2)

·层流净化罩

·解剖显微镜(MZ6; Leica)

·37摄氏度的水浴

·显微解剖器械(消毒): 小解剖剪刀; 杜蒙钳-直且成角; 弯曲显微解剖剪刀; 抹刀。

·台式离心机

·血细胞计数器

·轨道式摇床(Barnstead Digital Orbital Shaker, cat. no. SHKE2000)

·轨道式振动炉(Bellco Benchtop incubator)

·15ml塑料离心管(Falcon 352097)

·50ml塑料离心管(Falcon 352070)

·玻璃移液器(Fisher 13-678-27F)

·T75 cm²带塞密封组织培养瓶 (Fisher 13-680-59)

·6或24孔组织培养板(Nunc)

·无菌介质过滤器(0.22 mm)

·10cm培养皿(Fisher 08-757-13)

·70mu;m细胞过滤器(Falcon 352350)

·20或50mu;m无菌筛尼龙网(Sefar America;03-20/14或03-50/31)

试剂配置

DMEM20S DMEM, 4 mM L-谷氨酰胺，1 mM丙酮酸钠，20%胎牛血清，50 U/ ml青霉素和50mu;g/ml链霉素。保质期:4℃保存2周;

基础化学定义培养基 DMEM, 4 mM l -谷氨酰胺，1 mM丙酮酸钠，0.1% BSA, 50 mu;g/ml转铁蛋白，5mu;g/ml胰岛素，30 nM亚硒酸钠，10 nM D-生物素和10 nM皮质醇。保质期:4℃保存2周;

OPC培养基 基础化学定义培养基(BDM)含10ng/ml PDGF-AA和10 ng/ml bFGF。保质期:4℃保存2周;

?关键：生长因子应准备1000 x备用且存储在-80℃。在OPC培养或介质更换之前添加到BDM中.

NAC原液1000x 将50mg NAC (Sigma A8199)溶于10ml DMEM中，用1N HCl调节pH至7。将40mu;l水分成等份;贮存在-20℃;

少突胶质细胞分化培养基BDM含有15 nM三碘甲状腺原氨酸，10 ng/ml的CNTF和1x NAC。保质期:4℃保存2周;

注:CNTF和NAC可促进少突胶质细胞存活^[25]。

神经培养基DMEM/F12加25mg/ml胰岛素，100mu;g/ml转铁蛋白，20 nM孕酮，60mu;M腐胺，30 nM亚硒酸钠。保质期:4℃保存2周;

神经球生长培养液(NCM) 神经培养液(NCM)加20 ng/ml bFGF和20 ng/ml EGF。保质期:保存一周 4℃;

?关键无血清培养基(SFM)中生长因子的生物活性会随着时间的推移而降低。为获得最佳效果，可在制备当天向SFM添加生长因子。一般情况下，我们将SFM与生长因子一起储存在4℃下，储存7天以供神经球传代。

B104生长培养基(用于B104神经母细胞瘤细胞生长)添加了10%胎牛血清的DMEM/ F12;

N2介质DMEM/F12加1xN2;

B104神经母细胞瘤条件培养基(B104 CM) 在B104生长培养基中培养B104神经母细胞瘤细胞，直至汇合。用1xPuck的BSS清洗且用N2培养基培养。4天后，收集培养基，添加苯甲基磺酰氟到最终浓度1mu;g/ml，通过旋动快速混合，在4℃的摆动斗离心机中2000g离心30分钟。用0.22 mm孔径的过滤系统过滤上清液，保留过滤后的上清液。这就是B104CM。保质期:在-80℃下可达6个月;

?关键: B104CM应在-80℃保存以备后用。为尽量减少培养基间的差异，每批B104-CM在使用前应进行检测。尽量减少冻融循环次数，不超过两次。

寡球基质 7份NCM:3份B104CM(7:3=容积:容积):该培养基可在4℃下保存2周;

10 x Puck s BSS在1000ml的三蒸水中加入NaCl 80 g, KCl 4 g, Na₂HPO₄ ·7H₂O 0.9 g, KH2PO4 0.4 g及葡萄糖10 g并且通过过滤器灭菌(0.22 mu;m)存储在4℃。此溶液是1xPuck的BSS。用无菌三蒸水将原液稀释到1:10，在组织培养罩中进行无菌处理;

胰蛋白酶储备液 0.25% (w/v)胰蛋白酶在HBSS中且保存于-20℃的均分液中;

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