通过直接谱系转换产⽣少突胶质细胞外文翻译资料

通过直接谱系转换产⽣少突胶质细胞

原文作者：Nan Yang , J Bradley Zuchero, Henrik Ahlenius, Samuele Marro, Yi Han Ng, Thomas Vierbuchen, John S Hawkins、Richard Geissler、Ben A Barres和 Marius Wernig.

单位：Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, Stanford, California, USA. Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, Stanford, California, USA. Departments of Neurobiology and Developmental Biology, Stanford University School of Medicine, Stanford, California, USA.

摘要：少突胶质前体细胞 (OPCs) 的移植是治疗影响髓鞘的疾病的一种有前途的潜在治疗策略。然⽽，从⼈类多能⼲细胞中提取可移植的OPCs已被证明是困难的，并且初级 OPCs 不易获得。在这里，我们报告了通过直接谱系转换产生的诱导 OPCs (iOPCs)。三种转录因⼦ Sox10、Olig2 和 Zfp536 的强制表达⾜以将⼩⿏和⼤⿏成纤维细胞重编程为 iOPC，其形态和基因表达特征类似于初级 OPC。更重要的是，iOPCs 产⽣成熟的少突胶质细胞，当与原代背根神经节细胞共培养时，可以包裹多个宿主轴突，并在移植到颤抖⼩⿏体内后形成髓鞘。我们建议将直接谱系重编程作为一种可行的替代⽅法，⽤于⽣成⽤于疾病建模和再⽣医学的 OPC。

OPCs 是分布在整个中枢神经系统中的常驻祖细胞。它们的主要作用是分化成少突胶质细胞，在脑发育期间用髓鞘包裹轴突，并在脑损伤后使轴突重新髓鞘化。髓鞘形成是一个复杂的生物学过程，涉及轴突识别和附着、膜包裹和压实以及髓鞘维持^[1,2]。通常认为这些任务是由 OPCs ⽽不是由成熟的少突胶质细胞完成的，因为在动物模型中的移植研究发现，移植的 OPCs 容易形成髓鞘，⽽成熟的少突胶质细胞则不会^[2]。因此，OPCs 已被确定为用于治疗髓鞘异常和脱髓鞘疾病的有前景的细胞群。特别是，影响髓鞘的遗传疾病，如 Pelizaeus Merzbacher 病和其他家族性脑白质营养不良，将是基于细胞的疗法的理想候选者。此外，更普遍的疾病，如脊髓损伤和多发性硬化症，可以从 OPC 移植中受益^[2,4,5]。值得注意的是，来自胎⼉⼤脑或胚胎⼲ (ES) 细胞的 OPC 已被证明可以在啮⻮动物的髓鞘疾病模型中使轴突重新髓鞘化，在某些情况下具有令⼈印象深刻的治疗益处 ^[6-11]。不幸的是，原代人体组织有限，ES 细胞分化缓慢且乏味。^[11-13] 因此，我们试图确定 OPCs 是否可以通过从现成的体细胞谱系（如成纤维细胞）的直接谱系转换来产⽣。

以前，我们确定了介导小鼠成纤维细胞直接快速有效地转化为功能齐全的神经元细胞的转录因子组合，我们将其称为诱导神经元 (iN) 细胞^[14]。我们和其他人进一步证明了从人成纤维细胞中产生 iN 细胞^[15]。我们的标准 iN 细胞因子与其他亚型特异性因子的组合允许产生神经元亚型，例如多巴胺和运动神经元^[16-18]；最近，小鼠成纤维细胞能诱导出三能神经前体细胞^[19-24]。

在这里，我们表明转录因子介导的重编程也可用于生成 OPC 样细胞。我们发现，三个因子 Sox10、Olig2 和 Zfp536 的强制表达将啮齿动物成纤维细胞转化为表达适当 OPC 标记的 iOPC，在 OPC 培养基条件下增殖，在体外分化为少突胶质细胞，并在移植到髓鞘脱发的颤抖小鼠大脑后使宿主轴突髓鞘化。

为了确定候选的 OPC 重编程因子，我们使用了来自详细的全基因组表达研究的数据，并过滤了与其他神经谱系相比在少突胶质细胞中具有更高表达的转录因子的基因^{[25, 26]}。我们选择了十个参与 OPC 规范各个阶段并在突变时导致严重的发育性少突胶质细胞相关缺陷的因素：Ascl1、Gm98、Myt1、Nkx2.2、Nkx6.1、Nkx6.2、Olig1、Olig2、Sox10 和 Zfp536。我们使用了一种经过充分表征的蛋白脂蛋白 (Plp)- EGFP 转基因小鼠品系，在 OPCs 和成熟的少突胶质细胞中表达 EGFP，作为 oli 神经突细胞存在的报告者^[27]。小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 培养物是从胚胎第 14.5 天 (E14.5) 胚胎肢体中分离出来的，这是一种组织来源，我们之前已经证明它产生的成纤维细胞群基本上没有表达神经元、神经祖细胞和神经嵴干细胞标记的细胞^[14]（图1a）。 Plp- EGFP MEF 用包含候选基因的十种不同慢病毒库转导，并在已知培养基中培养支持 OPC 扩散。根据荧光显微镜或流式细胞术分析，在未感染或感染对照病毒的培养物中未检测到 EGFP 表达。相反，在引入十种因子后约 7 天，培养物中出现了少量 EGFP 细胞。再过 14 天后，细胞被固定并用 O4 抗体通过免疫荧光分析，已知特异性标记少突胶质细胞和晚期 OPCs。这揭示了具有少突胶质细胞典型形态的 Plp-EGFP /O4 细胞的存在（图 1b和补充图1）。因此，十种候选因子的一些组合在一小部分感染细胞中诱导了少突胶质细胞特性。 为了确定向少突胶质细胞谱系重编程所需的最少数量的转录因子，我们首先确定是否有任何单一因子足以产生 EGFP 细胞。在十个候选者中，只有 Sox10 可以激活 Plp-EGFP 报告基因，尽管仅在一小部分受感染的细胞中（图1b）。然后，我们结合其余九个候选因子中的每一个测试了 Sox10 的重编程活性。四个因子（Nkx2.2、Nkx6.1、Olig2 和 Zfp536）显着增加了 Sox10 的活性以产生 EGFP 细胞（图1c）。在系统消除的综合过程中，我们确定 Sox10、Olig2 和 Zfp536 的组合是足够的最小因子以最高效率诱导 EGFP 表达（图1d，e）我们使用荧光激活细胞分选（FACS）独立重复这些实验，以确定1 周后 EGFP 细胞的比例，并观察到类似的结果（补充图2）。

图 1确定产生 iOPCs 的候选因素。 (a)测试候选 OPC 诱导因子的策略示意图(b)Plp-EGFP 细胞和 O4 标记的细胞在感染十因子池3 周后源自 MEF。单独 Sox10 的异位表达足以诱导 Plp-EGFP 阳性细胞。（c-e）转基因诱导后 3 周，用指定的因子组合对 Plp-EGFP 细胞进行定量。从至少 15 个随机选择的视野中，每 20 倍视野的平均 EGFP 细胞数。数据表示为平均值 plusmn; sd 比例尺，50 micro;m (b)

从大鼠成纤维细胞中产生 iOPC

鉴于原代大鼠 OPCs 的培养条件已得到广泛表征并且已经确立，我们测试了 Sox10、 Olig2 和 Zfp536 的组合是否可以将大鼠成纤维细胞转化为 OPC 样细胞（图2a）。我们观察到具有双极、OPC 样形态的大型增殖细胞簇（图 2b） ，可以在感染后 14 天 用 O4 抗体标记 ^{[26,28 ]}（图2c）。正如 EdU 掺入所揭示的，这些 O4 细胞响应血小板衍生的生长因子（PDGF，一种已知的 OPC 有丝分裂原）而增殖（补充图3）。我们还在感染后 20 天发现了一些 GFAP 星形胶质细胞，但没有发现 Tuj1 或 Map2 神经元（补充图4）。在确认对照大鼠纤维组织中不存在 O4 细胞后（补充图5），我们使用已建立的免疫淘选方法来纯化大鼠 O4 细胞，并在本研究的其余部分中将其用于进一步表征。当放置在含有 PDGF 的培养基中并且对另外三种 OPC 标记物 NG2、A2B5 和 S100beta; 染色呈阳性时，经过免疫淘洗的O4 细胞具有典型的 OPC 形态（图2d-g）。 来自免疫脱色 O4 细胞的基因组 DNA 的 PCR 分析证实了三种原病毒的整合（补充 图6）。由于成纤维细胞衍生的 O4 细胞响应 PDGF 增殖，表现出典型的形态并表达 OPCs 的关键标志物，我们将这些细胞称为 iOPCs。观察到的 GFAP 细胞可能表明星形胶质细胞受限祖细胞的产生或双能神经胶质受限祖细胞的自发分化。神经元的缺失表明没有诱导出中间三能神经祖细胞。

接下来，我们描述了重编程动力学和效率。由于成纤维细胞和 iOPC 都在增殖（图2h），因此无法确定真正的细胞转化效率。相反，我们评估了iOPC 产量，定义为感染后第 20 天 O4 免疫接种细胞数与感染成纤维细胞数之比（在线方法）。接种和感染 2.4 times; 10⁵成纤维细胞/cm² 后，约 25.9 plusmn; 4.9% 的成纤维细胞表达所有三个因子，诱导后 20 天平均可以恢复6.8 plusmn; 1.7 times; 10⁴个O4 细胞/cm² ，从而产生重编程产量在这个时间点约为 106.7% （图2i）。 iOPC纯度，定义为第20天O4免疫细胞与收获细胞总数的比率，平均为15.6plusmn;3.3％ （图2j）。我们假设产量和纯度值都略微低估，考虑到 O4 抗体强烈标记的细胞没有有效地从 O4 抗体包被的淘选板中分离出来。我们注意到产量是一个取决于重编程效率、细胞死亡和增殖的参数，因此真正的重编程效率几乎肯定会更低。事实上，O4 细胞的产量在较早的时间点显着降低，此时细胞增殖的影响可能较小（图2h）。此外，功能性 iOPCs 的产量甚至更低，因为 O4 细胞的分化效率约为新生儿原代 OPCs 的 25%。

图 2从大鼠成纤维细胞中诱导 OPC 样细胞。 (a)从大鼠胚胎成纤维细胞中提取和分离 iOPCs 的实验装置和策略示意图。 （b）感染后 3 周，通过三种因素（Sox10、Olig2 和 Zfp536）的组合，从大鼠成纤维细胞中提取的 iOPC 的相差图像。 (c)具有不成熟形态的 iOPCs 可以在感染后 3 周用 O4 抗体标记。 (d) O4-immunoppanned iOPCs 在增殖培养基中的相差图像。 （e-g）用额外的 OPC 标记物标记的O4 细胞，包括感染后 3 周的 NG2 （e）、A2B5 （f）、S100beta; （g） 。 (h) FACS 分析显示在重编程过程中 O4 细胞最初缓慢且随后呈指数增加，而在 OPC 扩增培养基中培养的 rtTA 病毒感染的成纤维细胞的总数不随时间变化。 (i,j)重编程产量由诱导后 20 天 O4 免疫细胞/cm² 的比率和感染后 48 ，小时异位表达所有三种重编程因子的成纤维细胞总数决定。数据以平均值plusmn;sem给出；单个数据点显示 为i中的bull;和j中的▲ 。第 20 天 iOPCs 的纯度由免疫淘选后回收的 O4 细胞与免疫淘选前收获的细胞总数的比率确定。比例尺, 100 micro;m (b), 50 micro;m (c,d), 20 micro;m (e-g)。

iOPCs 中的全局转录重构

我们接下来通过微阵列分析比较了大鼠iOPC、成纤维细胞、原代 OPC 及其分化后代的整体基因表达模式（图3）。描绘在任何样品之间差异表达至少两倍的所有探针组的热图显示，成纤维细胞的转录程序特征被全局重编程为少突胶质细胞系年龄（图3a）。与成纤维细胞相比，iOPCs 中上调的基因显着富集了与少突胶质细胞生物学相关的 GO 术语（显示的是 P lt;10^-9 的所有 GO 术语）。相反，具有显着丰富的涉及中真皮细胞功能的GO术语的成纤维细胞基因在iOPC中全局下调（图3a）。基因簇的人工检查表明，与成纤维细胞相比，许多已知参与祖细胞自我更新或寡核胶质细胞命运决定的基因，如 Sox2、Sox6 和 Nkx2.2，iOPCs 和 OPCs 中被强烈上调（图3a） .成纤维细胞特异性基因 Col1a1、Col5a1 和 Thy1 的转录水平显着下调（图3a）。我们通过定量 RT-PCR 证实了这些基因的表达变化（图 3c和补充表1）。与这些结果一致，无监督层次聚类分析和 Pearson 对所有差异表达基因的表达值的相关分析表明，iOPCs 的转录谱与原代 OPCs (r² = 0.42) 的转录谱比与成纤维细胞的更相似。 （r² = 0.15） （图3b）。定量 RT-PCR 分析表明，某些基因的 mRNA 水平与OPCs 的分化，如 Cdkn1c、Mbp、Mog 和 Plp1a，在 iOPCs 中的分化程度高于原代 OPCs，但低于成熟少突胶

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

英语原文共 7 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[597701]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word