基因编辑减数分裂和受精基因获得杂交水稻无性种子外文翻译资料

基因编辑减数分裂和受精基因获得杂交水稻无性种子

作者：Chun Wang¹, Qing Liu¹, Yi Shen², Yufeng Hua¹, Junjie Wang¹, Jianrong Lin¹, Mingguo Wu¹, Tingting Sun¹, Zhukuan Cheng² , Raphael Mercier ³ and Kejian Wang ¹

单位：1：State Key Laboratory of Rice Biology, China National Rice Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou, China.

2 ：State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China.

3 ：Institut Jean-Pierre Bourgin, INRA, AgroParisTech, CNRS, Universiteacute; Paris-Saclay, Versailles, France.

专业：生物技术 学生姓名：罗灶霞

指导老师姓名：黄小平

摘要：育种家利用杂种优势培育优良的高产作物品系，但由于遗传分离，在后代中丧失了有益的表型。通过种子进行无性系繁殖可以使F1杂种自繁。本文报告了一种通过种子实现F1水稻杂交种无性繁殖的策略。我们通过对REC8、PAIR1和OSD1减数分裂基因的CRISPR-Cas9多重基因组编辑，固定F1杂交稻杂合度，获得无性系二倍体配子和四倍体种子。基因（参与受精）可诱导杂交水稻单倍体种子的形成。最后，我们通过对杂交稻中的4个基因（REC8、PAIR1、OSD1和MTL）的同时编辑，将杂合性固定和单倍体诱导结合起来，获得了能够通过种子进行无性繁殖的植株。该方法的应用可以使广泛的优良F1杂交作物自繁殖。

遗传距离较远的个体杂交后代由于杂种优势，相对于纯合亲本，活力增加。杂种优势已被广泛应用于农业，以提高作物的生产力和适应性^[1，2]。然而，对许多作物来说，杂交种子的生产是非常昂贵的。合成无融合生殖已被认为是固定F1杂交种作物品种杂种优势的途径^[3]。无融合生殖是一种无性繁殖策略，其后代是通过种子产生而不经过减数分裂或受精。虽然无融合生殖在许多开花植物类群中已有描述^[4]，但在作物中尚未见报道。在拟南芥和水稻中，3个介导重要减数分裂过程的基因的联合突变创造了一个名为MiMe（有丝分裂而非减数分裂）的基因型，在该基因型中减数分裂被有丝分裂样分裂所取代，从而产生雌雄克隆二倍体配子^[5,6]。然而，MiMe植株的自交受精使每代倍性提高一倍。将拟南芥MiMe与CENH3介导的染色体消除系杂交产生克隆二倍体后代^[7]。然而，这个系统仍然依赖于杂交不同的植物，CENH3介导的染色体消除似乎不太可能转移到其他物种上^[8]。因此，我们着手设计一种在自交F1杂种中广泛适用的杂种优势固定方法。

首先，为了验证MiMe技术在杂交稻品种上的可行性，我们从粳稻雄性不育系春江16A（16A）和籼粳中间型杂交稻父本C84杂交后代中选出了优良的亚种间杂交稻lsquo;春优84rsquo;（CY84）（附图1）。为了保证MiMe在CY84杂交背景下的快速生成，我们利用我们前期开发的多重CRISPR - Cas9系统^[9]同时编辑了REC8、PAIR1和OSD1基因（图1a和附表1）。32株初代转化植株中有7株被鉴定为移码三突变体，其中3株被详细分析（附图2a，b）。三重突变体（MiMe）在生长情况和形态特征上都无法与野生型CY84区分（附图3）。为了检验减数分裂是否已转变为有丝分裂样分裂，我们研究了野生型和MiMe植物的雄性减数分裂染色体行为。在野生型CY84（补图4a-f）中，12对二价体在终变期分散，在中期Ⅰ沿赤道板排列，12对同源染色体在后期Ⅰ分离，第二次减数分裂后产生四分体。在MiMe（附图4g-i）中，在终变期时发现24个单价体，并在中期Ⅰ时对齐。在后期Ⅰ中，24对染色单体分成两组，并产生二分体，表明减数分裂变成有丝分裂。然后利用5S rDNA特异性探针对水稻11号染色体进行荧光原位杂交分析，检测了MiMe孢子的倍性。在CY84孢子（n=30）中只观察到一个信号，而在MiMe孢子（n=40，图1b）中则观察到两个信号，表明MiMe中产生了二倍体配子。我们还对MiMe突变体的育性进行了研究，发现MiMe中结实率为81.2 % （n=4,043），与野生型（79.1%，n=3，876）相当（图1c和表1），说明这三个基因同时编辑对该杂交种的育性没有明显影响。利用流式细胞仪对MiMe植株后代的倍性进行了研究，发现所有植株（n=123）均为四倍体植株（图1d和表1）。此外，这些后代植株（n=123）完全保留了CY84亲本对10个被测插入缺失标记（图1e和附表2）的杂合性。与野生型相比，MiMe自交后代表现出育性降低、籽粒增大、芒长拉长等特点，均为四倍体水稻的特征（图1f）。这些结果表明，利用CRISPR - Cas9基因组编辑技术可以将MiMe表型快速导入杂交水稻品种中。

附图1. 亚种间杂交水稻品种春优84(CY84)及其亲本的形态。

母本为晚粳不育系lsquo;春江16Arsquo;(简称16A )，父本为广亲和的籼粳中间型恢复系lsquo;C84rsquo;。用保持系春江16B ( 16B )与近等基因16A杂交，获得雄性不育16A种子。比例尺，5thinsp;cm。

图1. 杂交水稻品种CY84减数分裂转化有丝分裂图

(a). 靶向OSD1、PAIR1和REC8的CRISPR - Cas9载体的结构 (b). 利用地高辛素-16 - dUTP标记孢子中5thinsp;S rDNA ( 红色信号 ,用白色箭头表示)对CY84和MiMe染色体进行探测，在野生型CY84中显示1个信号，在MiMe中显示两个信号。DNA用4′，6 -二脒基-2 -苯基吲哚（DAPI ,蓝色信号 )染色。比例尺，5 mu; m (c).野生型CY84和MiMe的角质层。MiMe的育性与野生型CY84一样高。比例尺，2thinsp; cm (d).利用流式细胞仪对CY84 (左)和MiMe (右)子代进行倍性分析，分别发现为二倍体和四倍体(表1 )；PI，碘化丙啶 (e).父本C84、母本春江16A ( 16thinsp;A )、杂交品种CY84和MiMe后代兄弟姐妹的基因型分析。利用分布在第1条和第8条染色体上的10个插入缺失标记鉴定了MiMe后代的基因型。标记(棕色)和着丝粒(黑色)的位置沿染色体指示。对于每个标记，携带C84等位基因的植株呈红色，携带16thinsp;A等位基因的植株呈蓝色，同时携带C84和16thinsp;A等位基因的植株均呈黄色。每行代表一个植物，每列代表一个基因座 (f).CY84和MiMe后代的穗粒形状。MiMe的后代表现为育性降低，颖片大小增加，芒长拉长。比例尺，2thinsp;cm。

附图2. MiMe的基因组编辑结果。

( a ). MiMe的T0转基因植株的基因型。字母A - C分别代表OSD1、PAIR1和REC8基因。上例字母表示没有突变，而下例字母表示移码突变；较低的case*表示非移码突变。( b ) . MiMe- # 7、MiMe- # 8和MiMe- # 21的OSD1、PAIR1和REC8靶点周围突变的测序分析。野生型(WT)的前间区序列相邻基序和靶序列分别用红色和蓝色表示。符号-表示已删除的核苷酸。

附图3. 野生型CY84、MiMe和MTL的形态。

MiMe和MTL突变体表现正常营养生长。比例尺，5thinsp;cm。

附图4. 野生型CY84、MiMe和Fix花粉母细胞中雄性减数分裂的染色体扩展。

( a-f ) CY84 ( n = 32 ).（a）具有12个对齐的二价体的中期Ⅰ. ( b )后期Ⅰ. ( c ) 核分裂末期I. (d )中期Ⅱ. ( e )后期Ⅱ. ( f ) 核分裂末期Ⅱ. ( g-i ) MiMe ( n = 45 ). ( g )具有24个对齐单价的中期I。( h )具有24对染色单体的后期I.（i）核分裂末期 I . ( j-l )Fix( n = 52 )。( j ). 具有24个对齐单价的中期I.（k）具有24对染色单体的后期I.（l）核分裂末期I .比例尺，5 m。

图2. 通过编辑杂交水稻品种CY84中的MTL基因产生单倍体诱导系。

(a). 靶向MTL的CRISPR-Cas9载体 . 的结构示意图. (b). CY84背景下野生型和MTL的圆锥花序。MTL的育性下降；白色箭头表示流产的种子，红色箭头表示可育的种子。比例尺，2thinsp;cm. (c). 裁剪后的凝胶用12个插入缺失标记(每条染色体1个)表示单倍体、双倍体( DH )和重组自交系二倍体( RID )的基因型。MTL后代所有标记纯合的植株鉴定为单倍体或双倍体. (d). 流式细胞仪对单倍体和DH进行倍性分析(表1 )；PI，碘化丙啶. (e). 单倍体、DH和RID植株全基因组测序。12块代表12条染色体。C84等位基因的SNP为红色，16thinsp;A等位基因的SNP为蓝色，两种等位基因共存于黄色. (f). 野生型CY84和MTL后代的圆锥花序，包括RID、单倍体和DH植物。比例尺，2cm。

MiMe克隆配子参与正常的自交受精，产生双倍性的后代。必须防止这种倍性倍增，以达到无融合生殖。近来有报道称，编码精子特异性磷脂酶的MATRILINEAL（MTL）基因（又称NOT LIKE DAD和磷脂酶A1）突变引起玉米单倍体诱导^{[10 - 13]}。为了验证水稻同源基因是否可以在自交杂交水稻中操纵诱导单倍体，我们编辑了CY84中的MTL基因（图2a和附表1）。32株转化植株中有11株被鉴定为移码突变体，并对其中3株进行了分析（附图5a，b）。MTL突变体植株营养生长正常（附图3），但结实率降低到11.5%（n=5，180；图2b和表1）。利用12个在两个亲本间具有多态性的内模标记（每条染色体1条；附表2）来确定MTL植株后代的基因型。在野生型CY84的后代中，所有标记均未发现纯合植株（n=220；表1）。相比之下，来自248MTL子代的11株植物对所有标记似乎都是纯合的（图2c和表1）。流式细胞术显示，这些植物中9株确实是单倍体，2株是二倍体，推测可能是单倍体胚胎自发加倍所致（图2d和表1）。为了进一步对这些鉴定植株的基因型进行分类，我们对两个单倍体、两个MTL子代双倍体和两个野生型CY84子代植株的全基因组进行了30倍复盖率的测序，共筛选出78909个双亲本间差异的单核苷酸多态性位点，对其进行详细的基因型分析。全基因组测序显示，单倍体和双倍单倍体在所有染色体上都是纯合的（图2e），与亲本基因组相比都是重组的，表明它们各自来源于一个配子体。单倍体植株表现为株高降低，颖片变小，育性丧失，而双倍单倍体植株表现为正常的营养生长和穗生长（图2f）。结果表明，杂交品种自交可产生重组单倍体植株。

附图5. MTL的基因组编辑结果

( a )转MTL基因T0植株的基因型。D表示无突变，d表示移码突变，d *表示MTL的非移码突变。( b ) mtl- # 1、mtl- # 2和mtl- # 3 MTL靶点周围突变的测序分析。野生型( WT )的前间区序列相邻基序和靶序列分别用红色和蓝色表示。符号-表示已删除的核苷酸。

由于自交F1杂交稻中将减数分裂转化为有丝分裂和消除父本基因组都是可能的，我们通过同时编辑CY84中的OSD1、PAIR1、REC8和MTL4个基因来检验杂交稻诱导杂合固定而不额外杂交的可能性（图

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