植物小RNA结合蛋白1家族介导细胞间RNAi信号的运输。外文翻译资料

植物小RNA结合蛋白1家族介导细胞间RNAi信号的运输。

Running Title

SRBP1介导小RNA细胞间运动。

简短的摘要

在这项研究中，我们表征了一个保守的小RNA结合蛋白1（SRBP1）家族，该家族介导植物中非细胞自主si / miRNA的细胞间运动。 SRBP1是富含甘氨酸（GR）的RNA结合蛋白，通过其GR结构域，可促进siRNA在细胞间移动。 在感染的早期，SRBP1家族成员的表达阻止了病毒的传播。

摘要

在植物中，RNA干扰（RNAi）在生长和发育以及对环境输入（包括病原体攻击）的响应中起着关键作用。小干扰/ micro（si / mi）RNA的细胞间和系统运输是该调控途径的重要组成部分。目前，关于这些si / miRNA运动中涉及的分子制剂知之甚少。为了解决这种情况，我们采用了一种生化方法来鉴定和表征保守的小RNA结合蛋白1（SRBP1）家族，该家族介导非细胞自主的小RNA运输。在拟南芥中，AtSRBP1是富含甘氨酸的RNA结合蛋白，也称为AtGRP7，我们证明它结合了单链siRNA。病毒载体西葫芦黄色花叶病毒（ZYMV）被用于在功能上表征了AtSRBP1-4（AtGRP7 / 2/4/8）RNA识别基序（RRM）和GR域。基于细胞的研究表明，GR结构域对于SRBP1细胞到细胞的移动是必要和充分的。 我们的发现为将来在植物中移动sRNA信号传导剂的机制和功能研究提供了基础。

关键词

RNAi，小RNA结合蛋白家族，小RNA移动，非细胞自主蛋白，富含甘氨酸的蛋白质

介绍

与RNA干扰（RNAi）相关的过程的分子机制已得到很好的表征。此外，RNAi在基因调控，基因组稳定性，发育程序以及对生物和非生物胁迫的生理反应等过程中的作用已在动植物界得到了广泛的报道(Baulcombe, 2004; Hamilton and Baulcombe, 1999; Ketting et al., 2001; Qi et al., 2006; Voinnet et al., 1999)。在此RNAi途径中起作用的基本试剂是Dicer（在动物中）和DICER-LIKE（在植物中）蛋白产生的21至24个核苷酸（nt）大小类别的小干扰RNA（siRNA），它们会裂解双链（ds）RNA。这些siRNA被整合到ARGONAUTE蛋白（AGO）中，以调节转录后或转录基因沉默(Bologna and Voinnet, 2014)。另一类siRNA，即micro（mi）RNA，也属于21至24 个核苷酸大小，是编排相似生物学过程的主要参与者(Reinhart et al., 2002)。

在动物和植物中，已证明这些si / miRNA可以作为细胞自主或非细胞自主的物质发挥作用(Cai et al., 2018; Molnar et al., 2010; Shahid et al., 2018; Skopelitis et al., 2018)。在植物中，嫁接研究为RNAi的非细胞自主作用提供了第一个证据(Palauqui et al., 1997)。随后，确认siRNA既是非细胞自主信号，又是系统性信号传导剂(Hamilton and Baulcombe, 1999; Hamilton et al., 2002; Klahre et al., 2002)。对非细胞自主性miRNA的一项开创性研究确定了miRNA399是一种系统调节剂，可在植物磷酸盐胁迫反应中发挥作用(Bari et al., 2006; Lin et al., 2008; Pant et al., 2008)。此外，已经证实韧皮部系统在介导此类si / miRNA的长距离递送中的作用(Ham et al., 2014; Ham and Lucas, 2017; Lewsey et al., 2016; Molnar et al., 2010; Yoo et al., 2004)。

局部地，已经显示sRNA通过胞浆菌在细胞之间运输(PD) (Liu and Chen, 2018; Yoo et al., 2004)。然而，目前关于通过PD运输该siRNA的过程中涉及的分子机制的信息很少。已知介导siRNA的细胞间移动的唯一植物蛋白是从南瓜韧皮部中鉴定的PHLOEM小RNA结合蛋白1（CmPSRP1）。(Yoo et al., 2004) 此CmPSRP1选择性结合单链siRNA（ss-siRNA），并以核糖核蛋白（RNP）复合物的形式介导这些siRNA的细胞间运动(Yoo et al., 2004; Ham et al., 2014)。CmPSRP1磷酸化增强了这种RNP复合物的稳定性，从而使结合的siRNA信号传导剂可以进行长距离全身运输(Ham et al., 2014; Liu and Chen, 2018)。但是，尚未在其他植物科中鉴定出CmPSRP1同源物。 因此，在植物界对RNAi的研究中，涉及运输非细胞自主siRNA的保守RBP仍然是瓶颈。

不幸的是，先进的遗传方法尚未发现在sRNA的细胞间运输中起作用的其他候选物。 这可能反映了基因冗余和与多家族成员基因敲除相关的挑战。尽管现已提供功能强大的CRISPR / Cas9基因组编辑工具(Minkenberg et al., 2017; Wang et al., 2014)，在确定新的非细胞自主性sRBP候选基因之前，不能使用这些基因功能分析方法。

在这项研究中，我们使用葫芦韧皮部系统来筛选此类额外的sRBP，条件是必须在整个植物基因组中都存在候选基因。 我们在这里报告

保守的小RNA结合蛋白（SRBP1）家族的特性研究，该家族在介导植物的非细胞自主siRNA转运中起作用。

结果

筛选可识别新的非细胞自治SRBPs

迄今为止，可能由于基因冗余，尚未通过正向遗传筛选鉴定出SRBP。 因此，由于韧皮部包含许多sRNA，它们可能以RNP复合物的形式存在(Ham et al., 2014; Ham and Lucas, 2017)，我们将葫芦韧皮部渗出液与RNA亲和层析结合使用，以筛选新的候选SRBP。对于RNA色谱，我们选择了两种已知的韧皮部流动sRNA作为诱饵(Sattar et al., 2012; Yoo et al., 2004)。从黄瓜，南瓜和西瓜中收集的韧皮部分泌物从黄瓜，南瓜和西瓜中收集的韧皮部分泌物经过筛选，检测到多个条带，随后通过LC-MS / MS鉴定蛋白质。在这里，在所有三个葫芦中都保守的16 kDa区域中的一种蛋白质被称为小RNA结合蛋白1（SRBP1），并且由于被子植物基因组中的近亲存在，因此它被选择作进一步研究。SRBP1的结构分析确定了N末端RNA识别基序（RRM）和C末端富含甘氨酸（GR）的域的存在(Supplemental Figure 1B and 1C)。

为了评估SRBP1的sRNA结合能力，进行了RNA共免疫沉淀（co-IP）分析。 为此，重组黄瓜（Cs）SRBP1-4M8H在本氏烟草中瞬时表达并从中纯化（图1B和1C）。同样地，从成熟黄瓜叶中提取总RNA，并使用PEG8000色谱法富集内源性低分子量RNA（LMW RNA）(Hamilton and Baulcombe, 1999)。将纯化的CsSRBP1-4M8H与该LMW RNA的等分试样一起孵育，并回收结合的sRNA，进行P放射性标记，然后通过PAGE分析。为了确定被CsSRBP1-4M8H结合的sRNA的形式，将该放射性标记的sRNA的等分试样进行单链（ss）-sRNA特异性RNase A处理。 该测试确定CsSRBP1-4M8H结合了ss-sRNA。为了进一步探索CsSRBP1的体内功能，我们使用葫芦感染的西葫芦黄色花叶病毒（ZYMV）作为病毒载体（图1F），因为它已被证明是分析内源基因功能的有效工具，例如FLOWERING LOCUS T(Lin et al., 2007; Yoo et al., 2013)。

在这里，有趣的是，接种ZYMV-CsSRBP1的植物最初仍然没有症状，而ZYMV-GFP对照显示出典型的感染症状。使用ZYMV衣壳蛋白（CP）抗体评估病毒的存在，该抗体以7 dpi确认ZYMV存在于ZYMV-GFP的全身叶片中，但未在接种ZYMV-CsSRBP1的植物中确认。此外，与该发现一致，在这些叶片中仅检测到非常低水平的病毒基因组。

我们的测定确定了CsSRBP1的表达可以抑制ZYMV感染的初始过程。 然而，在14 dpi时，接种ZYMV-CsSRBP1和ZYMV-GFP的植物均观察到全身症状（图1G），并且在14 dpi时在全身叶片中也检测到ZYMV CP和转录本。在ZYMV-CsSRBP1感染的南瓜植物中获得了可比较的发现（数据未显示）。我们的感染分析确定CsSRBP1是一种sRNA结合蛋白，在葫芦科植物的早期阶段，它可以危害ZYMV感染。

拟南芥的同系物也阻止ZYMV早期感染

为了确定CsSRBP1在模型植物拟南芥中是否具有同源物，进行了系统发育分析，我们鉴定了四个潜在的CsSRBP1同源物AtSRBP1-4（图2A）。 也标识为AtRBP7 / 8/2/4。与CsSRBP1一样，所有四个同源物都具有高度保守的RRM结构域，但是相比之下，对于这些拟南芥家族成员，GR结构域的长度可变。接下来，我们评估了AtSRBP1-4是否也可以阻断ZYMV感染。 为此，用带有-4编码序列的单个AtSRBP1的ZYMV接种黄瓜植株。在此，在7和14 dpi时，在接种ZYMV-AtSRBP4和ZYMV-GFP的植物上观察到全身症状。 但是，接种ZYMV-AtSRBP1，ZYMV-AtSRBP2或ZYMV-AtSRBP3的植物在7 dpi时仍无症状，但在14 dpi时表现出症状（图2C）。 免疫印迹试验证实了这些发现。在我们的测定中，我们使用ZYMV病毒载体在病毒接种/感染的细胞中表达SRBP。 自然地，由于插入的SRBP是病毒序列的一部分，因此它会受到RNAi的影响，因此，这些产生的小干扰（si）RNA也可能导致宿主CsSRBP1沉默。为了测试CsSRBP1沉默本身是否会导致病毒感染延迟发作，我们首先检查了CsSRBP1和AtSRBP1-4之间的序列消化。 在这五个基因中，RRM结构域确实显示出高序列同源性，而GR结构域显示出较低的序列同源性。

由于观察到天然CsSRBP1表达在下午6:00达到峰值（补充图1D），我们测试了ZYMV-CsSRBP1 / RRM CsSRBP1 / GR CsSRBP1轰击区域和系统感染叶片中天然CsSRBP1的表达。

在两个测试组织中，与ZYMV-CsSRBP1或ZYMV-GR CsSRBP1相比，ZYMV-RRM CsSRBP1更有效地沉默了天然CsSRBP1。但是，在这种情况下，ZYMV-RRM CsSRBP1对CsSRBP1的沉默不会对病毒感染产生负面影响

159为了探索ZYMV基因组中SRBP的存在是否可能在复制步骤中阻止感染，我们接下来用ZYMV-AtSRBP1或ZYMV-AtSRBP4接种BY2原生质体。 这些测定确定可以从所有处理中扩增ZYMV转录本，从而表明AtSRBP1或AtSRBP4的表达似乎不影响ZYMV复制（图2F）。 综上所述，这些结果表明AtSRBP1，AtSRBP2和AtSRBP3可以抑制ZYMV感染的早期阶段。

ZYMV通过删除SRBP GR域恢复感染

为了探索克服SRBP介导的ZYMV感染抑制的机制，从而实现全身感染，我们首先以7 dpi测试了全身叶中AtSRBP1-4的存在。有趣的是，检测到AtSRBP4和GFP（对照），而这些全身叶片中没有AtSRBP1-3的信号。接下来，我们通过RT-PCR测试ZYMV载体是否存在相应的AtSRBP编码区，并确定AtSRBP1-3被部分删除，而AtSRBP4和GFP对照则保持完整。这些发现为以下假设提供了支持：在接种的细胞中完整AtSRBP1-3的存在会损害ZYMV的局部扩散，从而延迟全身感染。

为了鉴定缺失的SRBP区域，在感染过程中，对从局部接种和全身感染的叶片中提取的RNA进行了RNA-Seq分析。 在这两种情况下，GR域的AtSRBP1编码区均已从ZYMV向量中截断。在携带AtSRBP2或AtSRBP3的ZYMV中也观察到了类似的结果。相比之下，ZYMV感染过程中AtSRBP4和GFP均未突变。这些发现清楚地表明，AtSRBP1-3的GR结构域对于AtSRBP1-3阻断ZYMV局部和全身感染的能力至关重要。

AtSRBP1-3 GR域对于破坏ZYMV感染是必要且足够的

为了评估RRM和GR域在破坏ZYMV感染中的功能，我们分别将AtSRBP1的RRM和GR域构建到ZYMV病毒载体中。在接种的黄瓜全身叶片中，分别以7和14 dpi检测到RRM AtSRBP1，并且在病毒载体中编码区保持完整。在这些症状组织中，ZYMV CP被清楚地检测到。这些结果表明，RRM AtSRBP1域不抑制ZYMV感染。 相比之下，在用携带GR AtSRBP1的ZYMV病毒载体接种的植物中，在7 dpi全身叶片中未检测到ZYMV CP（图4E），并且在这些叶片中我们无法检测到GR AtSRBP1（图4B），并且这些叶片没有症状。但是，在14 dpi时，在全身叶片上观察到症状（补充图3B和3H），但此处未检测到GR AtSRBP1信号。此外，在这些全身组织中，GR AtSRBP1结构域已从病毒载体中部分缺失，从而恢复了感染。

同时，我们还分析了AtSRBP2和AtSRBP3的RRM和

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