葡萄皮中类黄酮生物合成相关基因受到温度的差异调控和光照条件

作者：Akifumi Azuma, Hiroshi Yakushiji ,Yoshiko Koshita ,Shozo Kobayashi

单位:Grape and Persimmon Research Station, National Institute of Fruit Tree Science, National Agriculture and Food Research Organization, NARO, Akitsu 301-2, Higashi Hiroshima, Hiroshima 739-2494, Japan.

摘要：温度和光照是影响葡萄皮类黄酮生物合成的重要环境因素。然而，温度和光对类黄酮生物合成的影响之间的相互关系尚未在分子水平上得到充分阐明。本研究利用分离的葡萄果实进行体外环境实验，研究了温度和光照条件对黄酮类物质（花青素和黄酮醇）生物合成及相关基因表达水平的影响。在低温(15℃)加光处理下，葡萄皮中有足够的花青素积累而高温(35℃)或暗处理严重抑制了花青素的积累。这表明花青素的积累既依赖于低温，又依赖于光。qRT-PCR分析显示，三个MYB相关基因(VlMYBA1-3、VlMYBA1-2和VlMYBA2)对温度和光的反应差异很大，尽管这三个基因的产物都具有调节花青素生物合成途径基因的能力。此外，其他MYB相关基因和许多类黄酮生物合成途径基因的表达水平均受温度和光的独立调控。我们还发现温度和光照条件通过影响类黄酮生物合成途径基因的调控来影响果皮花青素组成。我们的研究结果表明，低温和光对类黄酮生物合成途径中基因的表达有协同作用。这些发现为葡萄环境因素与皮类黄酮积累的关系提供了新的信息。

关键词：花青素； 黄酮醇； 葡萄； 颜色； 光照温度

引言

花青素和黄酮醇等黄酮类化合物是植物次生代谢物，在果实、花和叶中积累。黄酮类化合物在抵抗紫外线和病原体以及吸引动物传粉媒介方面发挥重要作用。此外，许多研究人员研究了葡萄和葡萄酒中的类黄酮对人体健康的有益影响。这些益处包括抗氧化活性、预防冠心病、抗癌活性等。由于这些原因，了解类黄酮生物合成如何受到温度和光照等环境条件的影响是很有价值的，因为这些知识可能有助于类黄酮葡萄的开发和生产。

葡萄的皮色主要由花青素的含量和组成决定，而黄酮醇通过与花青素的共色素作用而有助于葡萄酒的颜色。已分离出编码葡萄中类黄酮生物合成途径酶的基因表明 UDP-葡萄糖基因的表达：类黄酮3-O-葡糖基转移酶(UFGT) 对葡萄中的花青素生物合成至关重要。表明花青素的生物合成受转录复合物控制，该转录复合物由属于 MYB、bHLH 和 WD40 类的三种调节蛋白组成，它们激活类黄酮途径中的结构基因。在葡萄中，已分离出一些与MYB相关的转录因子的基因，并显示它们可以调节花青素的生物合成。两个调节花青素生物合成的MYB相关转录因子基因VvMYBA1和VvMYBA2已从Vitis vinifera葡萄中分离出来，而三个功能性MYB相关基因（VlMYBA1-2、VlMYBA1-3和VlMYBA2 ) 存在于巨峰葡萄基因组中。对于黄酮醇生物合成，需要黄酮醇合酶 (FLS) 的活性。唐尼等人表明FLS的表达在成熟过程中增加，这与黄酮醇在葡萄皮中的积累一致。最近，Czemmel 等人分离出 MYB 相关转录因子 MYBF1 并证实它是FLS。此外，一些报告表明 MYB5a、MYB5b、MYBPA1 和 MYBPA2 似乎在类黄酮途径的常见步骤中调节多个基因。温度和光照是影响许多植物中类黄酮生物合成的重要环境因素。在葡萄中，葡萄皮中花青素的积累始于成熟（转色期）之后，并受到葡萄园环境条件的影响。克莱维尔和托雷斯（1972) 报道说，在15至25℃的白天温度和 10 至 20℃的夜间温度下，托卡伊葡萄的果实颜色最强，而白天35℃或晚上30℃的温度抑制了果实的发育的着色。较低温度(15℃)对“特拉华”和“巨峰”葡萄的较高簇温度影响颜色发展的影响更大。最近的研究表明，葡萄成熟阶段的低环境温度会增加花青素的积累，而高温会降低葡萄皮中黄酮类生物合成相关基因的表达并增加花青素的降解。

尽管已经进行了许多研究来确定环境因素对葡萄中类黄酮积累的影响，但我们的知识仍然不完整，因为这些研究在田间条件下很复杂，结果也存在很大差异。例如，在现场环境中很难区分温度和光线的环境影响。此外，难以控制用于实验的田地的营养状况。由于这些原因，关于温度和光照对葡萄皮中类黄酮积累的相互关系的报道很少。此外，尚未阐明黄酮类生物合成途径基因和MYB如何相关基因对温度和光的各种组合作出反应。在这项研究中，我们使用分离的葡萄进行了体外环境实验，以阐明温度和光照对类黄酮积累和类黄酮生物合成相关基因表达的相互关系。

材料和方法

使用分离的葡萄进行体外环境实验

开始变色的葡萄（葡萄的早期）是从成熟的葡萄藤中采集的。生长在日本广岛国家果树科学研究所葡萄和柿子研究站的一个葡萄园中。本研究中使用的葡萄的重量和总可溶性固体分别为10.6–11.9g和 9.2–10.8°Brix（数据未显示）。葡萄的表面在含有0.02% Tween 20(v/v)的1%次氯酸钠(v/v)中消毒10分钟，然后在无菌蒸馏水中洗涤3次。将灭菌的葡萄置于0.7%琼脂培养基上，每次处理三组15个葡萄，在培养箱中在以下四种条件之一下培养10天：15℃/光（白光（冷阴极荧光灯） 紫外光（FL10BLB，东芝，日本），80 mu;mol m^-2s^-1, 连续照射),15℃/dark, 35℃/light,和35℃/dark。培养后，剥去葡萄皮，立即在液氮中冷冻，并保持在-80℃直到需要。该实验进行了两次：一次是在2008年，一次是在2009 年。

花青素含量、组成、黄酮醇含量分析

花青素分析按照Shiraishi等人的描述进行。总花青素含量以花青藻苷-3-单葡萄糖苷的毫克表示，相当于每克新鲜的葡萄皮。通过高效液相色谱法分析花青素组合物。溶剂A为1.5%磷酸 (v/v)，溶剂B由1.5%磷酸(v/v)与20%乙酸(v/v)和25%乙腈(v/v)组合而成。在0.8 mL/min的流速下，溶剂B的比例在40分钟内从25%线性增加到85%。花青素组成被确定为各个峰的面积与所有峰的总面积的百分比。如 Mazza 等人所述分析总黄酮醇含量，稍作修改。用10 mL的70%甲醇(v/v)和2%甲酸(v/v)稀释样品（每个约1 g）。将0.25 mL样品量入试管中，加入4.75 mL 0.2 M 醋酸钠/盐酸溶液（pH 1.0）。将溶液彻底混合并静置约15分钟，并用分光光度计读取360nm处的吸光度。

脱落酸 (ABA) 含量分析

采用 Kojima 等人的方法，在4种环境条件下分别对2008年实验中葡萄皮中的ABA含量进行了3次分析。将每个样品 (1 g) 添加到作为内标的²H₆ -ABA中，并将混合物在含有100mgL^-1的冷(约4 ℃)80%丙酮中均质化使用 Polytron制备丁基羟基甲苯。过滤所得提取物并通过旋转蒸发除去丙酮。将溶液的pH值调节到2.5，酸化的水相用乙醚分配3次。将有机层蒸发至干。使用ODS柱通过HPLC进行进一步纯化。收集对应ABA标准的洗脱区并真空浓缩至干。将残余物用10%甲醇(v/v)中的1mL二乙醚和400mu;L重氮甲烷进行甲基化。通过蒸发除去试剂并将残留物溶解在200mu;L乙腈中。

MYB相关基因和类黄酮生物合成相关基因的qRT-PCR表达分析

如Reid等人所述提取总RNA。来自四个实验条件中的每一个的三个样品，并使用PrimeScript II cDNA 合成试剂盒 (Takara, Shiga, Japan) 合成 cDNA，如制造商手册中所述。我们测定了MYB相关基因（VlMYBA1-2、VlMYBA1-3、VlMYBA2、MYB4、MYBPA1、MYB5a、MYB5b和MYBF1）、类黄酮生物合成相关基因（查耳酮合酶[CHS]2和CHS3、查耳酮异构酶[CHI]1和CHI2、黄烷酮3-羟化酶[F3H]1和F3H2、黄酮3-羟化酶[F3H]、黄酮35-羟化酶[F35H]、二氢黄酮4-还原酶[DFR]、无色花青素双加氧酶[LDOX]、UDP-葡萄糖：类黄酮3-O-葡糖基转移酶[UFGT]、O-甲基转移酶[OMT]、谷胱甘肽-S-转移酶[GST]、antho-MATE、黄酮醇合酶[FLS4]；图1) 和9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶1(NCED1)，使用7300实时PCR系统和QuantiTect SYBR Green PCR 试剂盒，通过定量实时PCR (qRT-PCR) 在葡萄皮中参与ABA生物合成的基因, 如制造商手册中所述。用于扩增本研究中分析的基因的引物信息在表1中给出。通过基于标准曲线的方法确定每个基因的相对表达水平。每条校准曲线的标准 DNA 是通过对每个基因的质粒 DNA 进行一系列五次稀释来制备的，以覆盖模板浓度的范围。使用校准曲线计算数据并针对泛素1进行标准化。每个样品重复3次 qRT-PCR，每个基因的平均表达水平计算为相对于泛素1拷贝数的摩尔比。使用Tukey-Kramer检验评估统计显着性。

图 1：通过特征性MYB基因的产物简化了黄酮类生物合成的途径及其在葡萄中的调控（以蓝色显示）。一些基因存在多个拷贝。CHS查耳酮合酶、CHI查耳酮异构酶、F3H黄烷酮3-羟化酶、F3H黄酮3-羟化酶、F35H黄酮35-羟化酶、DFR二氢黄酮醇4-还原酶、LDOX 无色花青素双加氧酶、UFGT UDP-葡萄糖：类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶，OMT O-甲基转移酶、GST 谷胱甘肽-S-转移酶、antho-MATE花青素多药及毒性挤出、FLS黄酮醇合酶。粉红色阴影表示花青素。黄色阴影表示黄酮醇。

结论

1. 体外环境实验中的总花青素含量及组成

15℃/光照处理的葡萄在孵化4-5天后开始显色，并且在孵化10天后观察到足够的着色，而高温（35℃）或黑暗处理严重抑制了花青素的积累（图2a）。2008年试验葡萄皮总花青素含量分别为0.76、0.08、0.06和0.03 mg g^-1鲜重，15℃/光照、15℃/黑暗、35℃/光照和35℃/暗处理（图2b）。15℃/光照处理的总花青素含量显着高于其他三种处理。2009年试验各处理的总花青素含量与2008年试验相近（图2b）。这些结果表明，低温光照诱导了花青素的积累，但暗处理或高温处理严重降低了花青素的积累。

处理的花青素组成如图3所示。尽管由于处理过的葡萄皮的总花青素含量太低，无法确定35℃/黑暗处理中葡萄皮的花青素成分，但其他三种处理中的花青素成分不同。在15 ℃/光照下，芍药苷和锦葵花素衍生物占主导地位（分别占总花青素含量的40.2%和28.1%），但锦葵花苷衍生物的

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