3-羟基丙酸循环中自养光合细菌固定CO2的关键酶——光合绿丝菌的丙酰辅酶A合酶外文翻译资料

3-羟基丙酸循环中自养光合细菌固定CO₂的关键酶——光合绿丝菌的丙酰辅酶A合酶

摘要：3-羟基丙酸循环被认为是光营养绿色非硫细菌（Chloroflexus aurantiacus）和一些化能营养古细菌的一种新的自养CO₂固定途径。该循环需要特征中间体3-羟基丙酸还原转化为丙酰辅酶A。3-羟基丙酸、辅酶A、K 的比活性，自养细胞中NADPH的MgATP依赖性氧化为0.09mu;mol min^-1 mg^-1蛋白，在异养生长的细胞中下调2倍。出乎意料的是，一种酶催化整个反应序列：3-羟基丙酸 MgATP 辅酶A NADPH H →丙酰辅酶A MgAMP PP_i NADP H₂O。该酶纯化30倍至接近均一，天然分子量在500至800 kDa之间，根据SDS-PAGE判断，亚单位约为185 kDa，表明为同源三聚体或同源四聚体结构。当这种新酶——称为丙酰辅酶A合酶——经胰蛋白酶孵育后，该酶的NADPH氧化功能丧失，而该酶仍将3-羟基丙酸激活为其辅酶A硫酯，并将其脱水为丙烯酰辅酶A。SDS-PAGE显示丙酰辅酶A合酶的亚基被裂解一次，并测定了两种胰蛋白酶消化产物的N端氨基酸序列。在一个不完整的光合绿丝菌基因组数据库的两个重叠群上鉴定了编码丙酰辅酶A合成酶（pcs）的两部分基因，并完成了pcs基因的序列测定。丙酰辅酶A合酶是一种201 kDa的天然融合蛋白，由辅酶A连接酶、烯醇辅酶A水合酶和烯醇辅酶A还原酶组成，该还原酶结构域包含胰蛋白酶裂解位点。类似的多功能大型酶在次级代谢（如聚酮合成酶）中很常见，但在初级代谢（如真核生物I型脂肪酸合成酶）中很少见。这些结果为自养CO₂固定途径的运作提供了有力的支持。

关键词：3-羟基丙酸循环；丙酰辅酶A合酶；光合绿丝菌

一种称为3-羟基丙酸循环的新的自养CO₂固定循环已被提出用于光合绿丝菌（1-6）。这种细菌属于绿屈菜科，它代表光营养细菌的五个主要谱系之一（7）。在异养条件下，光合绿丝菌在55℃下生长最为理想，但也可以在以CO₂为唯一碳源的矿盐培养基中生长（4,8–10）。在温泉中，丝状绿曲霉菌和蓝藻形成微生物垫，可能以光自养方式茁壮成长（11）。对于克氏门的嗜酸性古细菌，如Acidianus brierleyi、Metallosphaera sedula和Sulfolobus metallicus（12-14），已经获得了自养CO₂固定类似途径的操作指示。

拟议的3-羟基丙酸循环如下图1所示。循环的每一轮都会导致两个重碳酸盐分子净固定为一个乙醛酸分子。乙酰辅酶A通过常规ATP依赖的乙酰辅酶A羧化酶羧化为丙二酰辅酶A。在体外，当NADPH，K ，辅酶A和MgATP添加到细胞提取物中，观察到丙二酰辅酶A直接还原为丙酰辅酶（6）。这一发现令人惊讶，因为这种转化形式上需要五种酶反应和3-羟基丙酸盐作为游离中间体（见图1）。3-羟基丙酸形成是该循环的特征；当细胞生长受到限制时，这种代谢物甚至会被排出体外（3）。最近，我们纯化了还原丙二酰辅酶A的酶，并证明它是一种双功能酶，需要两个NADPH并形成3-羟基丙酸盐（15）；3-羟基丙酸半醛是该工艺的中间体。这种新酶，丙二酰辅酶A还原酶，具有乙醇和乙醛脱氢酶（辅酶A酰化）活性；催化的两个部分反应如图1所示。

随后3-羟基丙酸盐还原转化为丙酰辅酶A通常需要三个酶反应。第一步，激活为3-羟基丙酰辅酶A，需要MgATP；ATP水解产物ADP或AMP尚未鉴定。这一理论对于估计自养CO₂固定的能量需求非常重要。到目前为止，假设有一种辅酶A连接酶催化该反应。第二步是通过烯酰辅酶A水合酶将3-羟基丙酰辅酶A脱水为丙烯酰辅酶A。第三步是通过烯酰辅酶A还原酶将丙烯酰辅酶A特异性还原为丙酰辅酶A。

本研究最初旨在纯化这些酶中的第一种，即假定的CoA连接酶，将3-羟基丙酸转化为其CoA硫酯。令我们非常惊讶的是，在光合绿丝菌的细胞提取物中存在一种酶，它催化3-羟基丙酸盐整体还原转化为丙酰辅酶A。对该酶进行了纯化和鉴定，并对编码该新酶的基因进行了识别鉴定。

图1。在光合绿丝菌中提出的自养CO₂固定的3-羟基丙酸循环。1.乙酰辅酶A羧化酶；2.丙二酰辅酶A还原酶，一种别处描述的双功能酶（15）；3.丙酰辅酶A合成酶，本研究中描述的三功能酶；4.丙酰辅酶A羧化酶；5.甲基丙二酰辅酶A差向异构酶；6.甲基丙二酰辅酶A变位酶；7.琥珀酰辅酶A：L-苹果酸辅酶A转移酶；8.琥珀酸脱氢酶，电子受体未知；9.富马酸酶；10.L-苹果酰辅酶A裂解酶。

材料和方法

细胞材料

光合绿丝菌菌株OK-70-fl（DSM 636）在55℃厌氧条件下在H₂/CO₂（80%/20%（v/v））或光异养条件下生长，如前所述（15）。以3.5-4.0的光密度（578 nm）收集细胞，并将其储存在液氮中直至使用。

3-羟基丙酸酯的合成

如前所述（2），通过水解3-羟基丙腈获得3-羟基丙酸盐。

酶测定

使用了两种分光光度测定法。（a）在标准分析中，在55℃下测量3-羟基丙酸的ATP-、CoA-和NADPH依赖性还原。标准反应混合物（0.5 ml）含有100 mM Tris/HCl（pH 7.8）、2 mM DTE、5 mM MgCl₂、10 mM KCl、3 mM ATP、0.5 mM CoA、0.4 mM NADPH和蛋白质。（b）ADP或AMP的形成在45℃下使用耦合分析进行测量。反应混合物（0.5 ml）含有100 mM Tris/HCl（pH 8.5）、2 mM DTE、2 mM MgCl₂、100 mM KCl、3 mM ATP、0.5 mM CoA、0.3单位的肌激酶、0.1单位的丙酮酸激酶、0.3单位的乳酸脱氢酶、0.5 mM NADH（或0.25 mM NADH加0.25 mM NADPH）和蛋白质。这两个反应均通过添加1 mM 3-羟基丙酸盐开始，随后在365 nm以牛血清白蛋白为标准，通过Bradford法（16）测定蛋白质浓度。

丙酰辅酶A合酶的纯化

所有程序均在4℃有氧环境下进行。

（i）细胞提取物的制备

将自养生长细胞的解冻细胞糊（10 g湿重）悬浮在含有0.25 mg DNA酶Ⅰ的15–20 ml缓冲液A（100 mM Tris/HCl（pH 7.8），5 mM MgCl₂）中，并在138 kPa下冷冻破碎两次。细胞裂解液在12000times;g下离心15分钟，上清液在100000times;g下再次离心1小时。

（ii）加热和硫酸铵沉淀

细胞提取物在63℃下培养30分钟，并在20000times;g下离心15分钟。将饱和硫酸铵溶液添加到上清液中，得到最终浓度为10%的（NH₄）₂SO₄溶液，并在100000times;g下离心1小时。

（iii）Phenyl-Sepharose色谱

将步骤ii的上清液上样到25mL Phenyl-Sepharose柱上，该柱用含有200mM硫酸铵的缓冲液A平衡。在80 ml洗涤后，在1 ml min^-1条件下，以250 ml递减线性梯度200–0 mM硫酸铵对柱进行冲洗，在120至80 mM盐之间洗脱活性峰值，并使用配备有10 ml膜细胞的超滤装置浓缩汇集的部分。

（iv）MonoQ色谱

将步骤iii中的浓缩酶溶液加到8-ml MonoQ HR 10/10阴离子交换柱（阿默森生物科学公司）上，该柱与缓冲液B（25 mM MOPS/NaOH（pH 7.2），5 mM MgCl₂）平衡。用15ml缓冲液B清洗色谱柱，并在1ml min^-1下以0-1M NaCl的线性梯度显影，丙酰辅酶A合酶活性在300-340 mM盐之间洗脱。将洗脱液汇集在一起，冻存在-20℃环境中。

（v）凝胶过滤层析

将步骤iv中的1 ml洗脱液上样到120 ml Superdex 200 HiLoad 16/60柱（Amersham Biosciences，Inc.）上，用20 mM MOPS/NaOH（pH 7.2）和100 mM NaCl进行平衡。柱的流速为1ml min^-1。如上所述浓缩组合活性组分，并将甘油和DTE分别添加至最终浓度为20%，1mM，保存在-20℃环境中。

酶的特性

CoA、ATP、3-羟基丙酸盐或丙烯酸酯的K_m值，以及3-羟基丙酸盐或丙烯酸酯的ATP-、CoA-和NADPH依赖性还原的NADPH的K_m值，使用在MonoQ色谱步骤和标准反应分析（a）后获得的丙酰CoA合酶测定。一种底物的浓度不同，而另一种底物的浓度保持不变；给出的浓度是饱和的。通过将标准反应分析中ATP、CoA或3-羟基丙酸盐的浓度更改为浓度10mu;M到0.1mM之间，来确定反应的化学计量比。反应完成后，通过测量365 nm处的总吸收变化来确定NADPH消耗量。在NADH和NADPH存在的情况下，使用分析（b）测定依赖于3-氢丙酸氧酯形成的AMP的化学计量比。3-羟基丙酸的ATP-、CoA-和NADPH依赖性还原在55℃时的最佳pH值是通过使用标准反应分析（a）确定的，使用100 mM而不是10 mM KCl，以及以下100 mM浓度（55℃时的pH值）的缓冲液（而不是100 mM Tris/HCl）：MOPS/NaOH pH值6.8-7.3，HEPES/NaOH pH值7.2-8.1，TAPS/ NaOH pH值7.7-8.9。通过将酶在30、40、50、60、65、72、77和90℃下培养15分钟来测定酶的热稳定性。在测定与整个实验中保持在4℃的样品相比的活性之前，将酶溶液冷却至4℃。K 和Mg² 通过从标准反应分析中省略KCl或MgCl₂并将其添加回规定浓度来测量相关性。3-羟基丙酸盐的ATP-、CoA-和NADPH依赖性还原对其底物的特异性是通过在标准反应分析中用10 mM中和的3-羟基丁酸、巴豆酸、丙烯酸酯、beta;-丙氨酸，取代3-羟基丙酸盐来确定的，或混合1 mM乙醇酸盐和丙二酸盐；ATP和3mM GTP和UTP；NADPH和0.4 mM NADH。使用Perkinlemer Life Sciences Lambda 2S光谱仪和与空白相同的缓冲液，在25℃下收集纯化酶的光学吸收光谱（20 mM MOPS/NaOH、pH 7.5、5 mM MgCl₂、300 mKCl、10%（w/v）甘油中的1.3 mg ml^-1）

天然酶的胰蛋白酶消化

第一份200mu;l纯化丙酰辅酶A合酶(1.0 mg ml^-1)，加入320mu;l 10 mM碳酸氢铵缓冲液(pH 8.0)，20mu;g胰蛋白酶。第二份加入320mu;l 10 mM碳酸氢铵缓冲液(pH 8.0)，不加入胰蛋白酶，作为对照。37℃孵化30分钟后，加入20mu;l 1mg ml^-1胰蛋白酶抑制剂。使用含有0.5 mM NADPH或0.5 mM NADPH或0.25 mM NADPH加0.25 mM NADH的分析（b）测量NADH和/或NADPH的ATP-、辅酶A-和3-羟基丙酸盐依赖性氧化活性以及每供应NAD（P）H使用的3-羟基丙酸盐的化学计量比。

表1

从10g（湿重）自养生长的光合绿丝菌中纯化丙酰辅酶A合酶

高效液相色谱分析

基于标准反应分析（a）的优化反应混合物（0.6 ml），使用了100 mM Tr

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