谷氨酸拮抗剂和抗帕金森药物对大鼠脑部多巴脱羧酶和5-羟色氨酸脱羧酶的相反的影响外文翻译资料

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谷氨酸拮抗剂和抗帕金森药物对大鼠脑部多巴脱羧酶和5-羟色氨酸脱羧酶的相反的影响

翻译：陈旭东，专业班级：生物技术1301，指导老师：张德禄

摘要：

本研究测量L-DOPA和5-HTP脱羧酶（DDC和5-HTPDC）在被利血平处理过得大鼠体内的活性。急性注射NMDA受体拮抗剂CGP 40116（5mg / kg）和HA 966（5mg / kg）和（10mg / kg），在两种结构中大大升高DDC，同时对（黑质）或抑制（纹状体）中的5-HTPDC没有影响。 L-DOPA（25mg / kg）本身在任一脑区域抑制两种酶。弱NMDA受体通道阻断剂（和抗帕金森病药物）布地品（10mg / kg）、美金刚胺（40mg / kg）和金刚烷胺（40mg / kg）强烈增加DDC，而不影响或降低黑质和纹状体中的5-HTPDC活性。 L-DOPA诱导的DDC抑制大多被所有的逆转三种抗帕金森药物，而L-DOPA诱导的5-HTPDC的抑制仅被CGP 40116（仅纹状体）逆转。结论是谷氨酸通过对脑中的多巴胺和5-HT的生物合成施加不同的生理学影响抑制DDC和刺激5-HTPDC。 L-DOPA诱导的DDC减少可能有助于解释最终的损失L-DOPA治疗帕金森病患者的疗效。然而，建议可以延长L-DOPA的寿命用能增强DDC活性的药物治疗，如布地品和1-氨基金刚烷。

关键词：芳香族L-氨基酸脱羧酶； L-3,4-二羟基苯丙氨酸；L-S-羟基色氨酸；利血平；金刚烷胺；美金刚胺；布地品；NMDA拮抗作用

1.引言

多巴胺和5-羟色胺（5-HT）的生物合成的第一步由底物特异性羟化酶催化，但随后的脱羧基反应似乎共享相同的酶，即芳香族L-氨基酸脱羧酶。尽管已经声明单个基因编码AADC，但是可能存在AADC的潜在不同基因型。然而，当使用L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）和L-S-羟基色氨酸（5-HTP）作为底物时，对于明显区分AADC的许多生物化学性质还没有令人满意的解释。因此，不仅两种酶在pH、温度和底物浓度方面表现出不同的最大值，而且它们也在脑区和亚细胞组织中的分布也存在差异。为了对应这些看似不一致的分子生物学和生物化学数据，提出AADC可以是对L-DOPA和5-HTP具有单独识别和调节的单一酶。

直到最近，DOPA脱羧酶（以下称为DDC）被认为是不饱和的和未调节的，因此对其并未进行深入的研究。然而，这个想法已经根本改变，研究发现DDC的活性受到翻译前和翻译后调节。增加DDC活性能力在治疗帕金森病中在临床上有着重要作用，其中由黑质纹状体多巴胺神经元的变性引起的DDC的消失可能导致用L-DOPA的多巴胺替代治疗的效果的最终失效。因此可能通过共同维持或甚至增加基底神经节中残余DDC的活性的药物来防止DDC在帕金森综合征中变成限速。 Hadjiconstantinou等人证明多巴胺受体拮抗剂适度地增加小鼠的DDC活性，但是在多巴胺缺乏型帕金森病患者中使用这样的药物会加剧它们的病情。另一方面，我们和其他人已经发现，各种N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂显著刺激大鼠的黑质纹状体多巴胺途径中的DDC，表明这些化合物的辅助使用可改善L-DOPA的药物治疗帕金森病。

L-DOPA不仅在多巴胺能神经元中被DDC脱羧，而且在5-HT能神经元中被5-HTP脱羧酶（此后称为5-HTPDC）脱羧。 由于5-HT神经元发芽占据在多巴胺损伤的脑中的多巴胺轴突漏出的突触，显然可能的是帕金森氏脑中的5-HT系统严重地参与用L-DOPA的多巴胺替代。

在研究谷氨酸拮抗剂对利血平处理的大鼠中黑质纹状体多巴胺系统对L-DOPA脱羧作用的研究过程中，我们注意到该脑区中的5-HTPDC对DDC与各种NMDA拮抗剂的反应不同。 本文将显示谷氨酸阻断强烈电位DDC而不是5 HTPDC，表明两种形式的脱羧酶由谷氨酸差异调节。

1. 实验所需材料及实验方法

2.1材料

甲醇（Rathburn，苏格兰）和其他色谱材料（Fluka，UK）均为最高档次。 利血平，alpha;-甲基对酪氨酸盐酸盐，L-DOPA，5-HTP，盐酸苄沙星，盐酸金刚烷胺，盐酸帕吉林和用于酶测定的一般化学品由Sigma（UK）（RS）-3-氨基 - 1-羟基吡咯烷-2-酮（HA 966）获自Tocris（UK）。 依利罗地（Synthelabo Recherche，Bagneux），R-DL-（E）-2-氨基-5-膦酸戊二酸（CGP 40116; Ciba Geigy，Basel，瑞士），布地品（Byk Gulden，康斯坦茨，德国）和美金刚（Merz， 法兰克福，德国）慷慨捐赠。

2.2动物及处理方法

使用体重200-260g的雄性Wistar白化大鼠（A.R.Tuck）进行这些实验。 所有实验均按照1986年“动物（科学程序）法”和当地道德委员会的指导方针进行。 大鼠最初在荧光照明下从07.00至17.00小时的条件下在22℃plusmn;2℃分为6组，并允许大鼠自由进入食物和水。 首先用利血平（5mg / kg）腹膜内（i.p.）注射动物。 第二天（18-20小时后），他们单独或与L-DOPA（25 mg / kg，给予苄丝肼，50 mg / kg，30分钟前提供）或盐水接受本文所示的药物 1ml / kg，对照）。 所有药物剂量均基于以前的研究。 一小时后，通过断头动物处死动物，将其大脑迅速排入冰冷的盐水中，并剥离黑质和纹状体。

2.3 DOPA和5-HTP脱羧酶的测定

该测定已在其他地方详细描述，并且基于Hadjiconstantinou等人描述的方法。将组织样品在0.25M蔗糖溶液（1ml，黑色，3ml用于纹状体）中均化，并将匀浆在Eppendorf管中以3000rpm离心10分钟通过Bradford方法测定100mu;l，1体积的上清液中的蛋白质20mu;l，1个如下测定DDC和5-HTPDC。孵育混合物（总体积400mu;l）由以下形成：磷酸钠缓冲液（pH7.2）; L-DOPA（0.5mM）或5-HTP（0.5mM）;抗坏血酸（0.1mM）;吡哆醛-5-磷酸（0.01mM）; 2-巯基乙醇（1mM）; EDTA（0.1mM）;帕吉林（0.1mM）;酶（20 p，1）。通过用水代替L-DOPA / 5-HTP底物测定空白值。在37℃下孵育10分钟，加入冰冷的80 p，1高氯酸（0.5M）停止。然后将混合物以3000rpm离心10分钟，并通过高效液相色谱（HPLC）测定所得上清液。 HPLC测定的全部细节已在其他地方给出。酶活性以nmol多巴胺或5-HT / mg蛋白/ h表达。 Sims等人报道了5-HTPDC测定的最适pH为8.3，但是在我们手中，该pH下5-HTP的脱羧速率没有显着增加（未发表的观察）。

2.4数据处理

结果计算为S.E.M. 至少六次单独测定。 比较药物和盐水治疗动物中的DDC和5-HTPDC活性，Dunnett t检验的方差分析和事后分析。 我们假设P lt;0.05。

1. 实验结果

3.1利血平处理对DDC和5-HTPDC的影响

接受利血平后的一天，腹腔注射5mg / kg，大鼠高度镇静，完全没有动力。 对于黑质和纹状体，DDC的基础活性分别为70.1plusmn;3.1和80.2plusmn;4.5nmol多巴胺/ mg蛋白/ h。 5-HTPDC的相应基础值分别为黑色和纹状体的30.5plusmn;5.0和28.3plusmn;1.6nmol 5-HT / mg蛋白/ h。 DDC对5-HTPDC活动在这些大脑区域的更大优势符合先前的发现。

3.2 NMDA受体拮抗剂对DDC和5-HTPDC的影响

NMDA多胺位点拮抗剂依利罗地（10mg / kg i.p.）在黑质中略有但显着升高的DDC活性（53％，P lt;0.05），但不在纹状体中（图2）。 相比之下，竞争性NMDA受体拮抗剂CGP 40116（5mg / kg ip）和NMDA甘氨酸位点拮抗剂HA 966（5mg / kg ip），在黑质中分别显着增强了DDC活性的430％和420％，纹状体中分别为280和170％（P lt;0.005）。

从图中可以看出，黑色中没有一种处理影响5-HTPDC。 然而，CGP 40116（41％，P lt;0.05），依利罗地（46％，P lt;0.05）和HA 966（53％，P lt;0.005）显着抑制了纹状体5-HTPDC活性。

将金刚烷胺（10^-7—7刚^-4M）加入到孵育混合物中对DDC或5-HTPDC活性没有显着影响（数据未显示），表明上述NMDA拮抗剂的作用是通过受体而不是通过受体 直接影响酶。

3.3抗帕金森药物对DDC和5-HTPDC的影响

多巴胺前体L-DOPA（25mg / kg i.p.）在黑质（P lt;0.05）和纹状体中降低了40％的DDC活性（P lt;0.05）。 在L-DOPA给药后，5-HTPDC活性的同时下降在黑质（44％，P lt;0.05）和纹状体（58％，P lt;0.005）中也是明显的。

与NMDA拮抗剂一样，急性注射抗帕金森药物利比汀（12.5 mg / kg ip; 201％，P lt;0.05）,美金刚（40 mg / kg ip; 94％，P lt;0.005）急性注射后黑质DDC活性的刺激明显， 和金刚烷胺（40mg / kg ip; 140％，P lt;0.005），如图所示。 布地品（91％，P lt;0.05）和金刚烷胺（41％，P lt;0.05），而不是美金刚，也显着增加纹状体DDC活动。

相比之下，5-HTPDC活性不受这些处理的影响或抑制。 因此，黑曲霉5-HTPDC活性显着降低了百分比（69％，P lt;0.05），但不是由1-氨基金刚烷中的任一种显着降低。 在纹状体中，美金刚5-HTPDC活性略低（30％，P lt;0.05），而不是布地品或金刚烷胺。

3.4反转L-DOPA诱导的DDC抑制谷氨酸拮抗剂和抗帕金森药物

图中显示，通过联合使用金刚烷胺gt;美金刚gt; CGP 40116gt;利比汀可以预防L-DOPA（25 mg / kg i.p。）对黑质和纹状体DDC活性的急性抑制，尽管布地品在黑质中是有效的。 另一方面，L-DOPA在两个脑区域诱发的5-HTPDC活性的抑制通常对这些辅助药物治疗不敏感，唯一的例外是通过CGP 40116在纹状体中5-HTPDC恢复到接近对照水平。

1. 讨论

4.1谷氨酸拮抗剂对DDC和5-HTP的反作用

上述结果表明，NMDA受体拮抗剂体内谷氨酸能神经传递的急性损伤对基底节神经元在单胺耗竭大鼠中脱羧L-DOPA和5-HTP的能力有不同的影响。 NMDA谷氨酸盐识别（CGP 40116），甘氨酸（HA 966）或离子通道位点（氨苄吡啶，金刚烷胺和美金刚）的阻断以及较少程度的多胺位点（依利罗地）均引起DDC的显着增加，而5-HTPDC不受相同治疗的影响或强烈抑制。已经有实质证据表明DDC活性可以通过视网膜中的生理刺激（光）来调节，并且本工作将该概念扩展到脑中的多巴胺和5-HT神经元。我们目前的观察表明，基底节神经节中的NMDA受体与控制DDC活性的因子负相关，并与5-HTPDC正相关，并且这些偶联可以形成反向浓缩，谷氨酸胺合成的生理控制的基础。这些酶活性的急剧变化可能涉及其磷酸化状态的改变。

不仅可以从这些实验中得出结论：DDC和5-HTPDC受谷氨酸差异调节，而且我们的研究结果也表明DDC和5-HTPDC可能作为单独的实体起作用。这是因为大脑的均质破坏了组织的任何自然分隔，并产生了两种酶同样暴露于添加的底物的混合物，无论是L-DOPA还是5-HTP。因此，如果DDC能够利用L-DOPA和5-HTP两者作为底物，则任何药物诱导的DDC活性增加不仅应加速L-DOPA的生物转化，而且还可以加速5-HTP的生物转化。显然这没有发生，这使我们得出结论，5-HTP不是DDC的底物，相反地，L-DOPA不是5-HTPDC的底物，至少在这里使用的体外孵育条件下。使用免疫组织化学实验方法，Hokfelt等得出了不同的结论，即DDC和5-HTPDC在免疫学上是不可区分的，可以利用彼此的底物。无论这些实验数据存在差异的原因，仍然有令人信服的证据表明L-DOPA在体内的负载可以增加5-HT神经元中的多巴胺荧光，并且以大剂量施用的5-HTP可类似地被摄取并转化为5-HT在儿茶酚胺能神经元中。因此，在特殊条件下，大脑中这些生物胺的来源变得更加扩散，并超出其天然神经元边界。

4.2利血平对DDC和5-HTPDC的影响

利血平治疗本身引起小鼠脑中DDC活性的适度增加和大鼠，最可能是由于耗尽脑多巴胺和通过多巴胺自身受体消除酶的反馈抑制的结果。相比之下，利血平对谷氨酸拮抗剂刺激DDC的能力有更深远的影响。在以前的完整大鼠研究中，我们发现依利罗地和CGP 40116不影响黑质或纹状体纹状体中的DDC，HA 966在刺激DDC方面仅有轻微的效果，然后仅在纹状体中发挥作用。然而，在这里，CGP 40116和HA 966大大提高了这两个脑区域的DDC活性，而氯氰菊酯显着增加了DDC（仅在黑质中的这个时间）。在黑质纹状体多巴胺途径变性之后，或利血平消耗多巴胺储存后，纹状体和纹状体输出途径中谷氨酸释放量继续增加。因此兴奋性神经传递的这种增加因此可以在

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