研究起始密码子（SCoT）标记揭示的金钗石斛属遗传多样性；一种濒危的药用兰花物种外文翻译资料

题目：研究起始密码子（SCoT）标记揭示的金钗石斛属遗传多样性；一种濒危的药用兰花物种。

1. 介绍

金钗石斛，一种附生兰花，归属于兰科植物属，是在全世界被发现的1184种石斛之一 (Leitch et al., 2009)。石斛主要分布于热带和亚热带地区 (e.g. Northeast India, China, Japan,Malaysia, Philippines and Borneo) ，在澳大利亚北部通常生长在更高海拔的气候条件下。在印度，103种石斛的发生中，其中84种就被发现存在于东北印度(Singh et al., 2001)。金钗石斛很大价值于它是一种很迷人的花，也是一种非常受欢迎的观赏性兰花；世界范围内的植物育种家提出了许多艳丽品种的花序(Nayak et al., 2002)。此外，它在传统的各种中药制剂中有很大的用处 (Ye et al., 2002)。双联苄（石斛酚和杓唇石斛素）和一种生物碱（石斛碱）化合物在金钗石斛中已经被报道(Miyazawa et al., 1997;Suzuki et al., 1973; Zhao et al., 2001)。这两种化合物已经被证明拥有较强的抗突变潜力，也被发现在肺癌、ovaryadenocarcinoma和白血病上都有抗致癌作用 (Lee et al., 1995)。金钗石斛茎被用来缓解口渴，镇静不安，加速康复，缓解口燥 (Faria and Illg, 1995)。在印度，这个兰花干膏对损伤及骨折外用都用作用(Hynniewta and Kumar, 2008)。因此由于其巨大的ethanobotanical，观赏性和生物制药的重要性而被过度开发了几个世纪以来，已在其自然栖息地成为威胁濒危物种(Singh et al., 2001)。因此迫切需要出现彻底的探索和分析的所有可用在金钗石斛自然遗传变异，从而实现其可持续发展利用。制定一个濒危物种的遗传变异的真实估计水平和分布是保护遗传学的主要目标(Fritsch and Rieseberg, 1996)。利用分子标记分析遗传多样性是一个值得信赖和可靠的方法，它可以提供有用的各种野生植物基线信息。

近年来，随着基因组研究的迅速发展，许多新的标记技术已得到迅速发展 (Gupta and Rustgi,2004)。由于公共生物数据库的巨大增长，在候选基因的位置或附近的功能标记的发展已变得相当容易 (Andersen and Lubberstedt, 2003)。启动一个趋势远离随机DNA标记对目标基因的标记，一个称为目标起始密码子的新的多态性标记系统（SCOT）(Collard and Mackill, 2009)多态性，在基于保守的侧翼区域的起始密码子在植物发育ATG基因得到发展。SCoT通常具有可重复性，它表现出引物长度和退火温度不是唯一的决定因素的重现性。这些像是随机扩增多态性DNA（RAPD）和显性标记intersimple重复序列（ISSR）可用于遗传分析，数量性状位点（QTL）映射和体的分离分析(Collard and Mackill, 2009)。原则上，苏格兰类似RAPD和ISSR，因为它们有相同的单引物作为正向和反向引物(Collard and Mackill, 2009; Gupta and Rustgi, 2004)。这些标记在多样性分析和诊断分析中的应用已成功地证明在花生，马铃薯和葡萄上(Gorji et al., 2011; Guo et al., 2012; Xiong et al., 2011)。本研究的主要目的是探讨在金钗石斛等利用SCoT标记开发保护策略野生种群的遗传多样性程度上可持续利用。

1. 材料和方法

2.1研究地点和样品采集

金叉石斛的六个自然群体的六十个个体在印度东北部被采集然后维持在植物生物技术实验室的温室，植物学系，高级研究中心，北东山大学，西隆，梅加拉亚邦，印度。由于每个种群中个体数量的稀少，所以在这样一种方法中，确定了采样大小，从而不破坏植物在野外的自然分布。这种采样策略也保证了金钗石斛的全地域范围在印度东北部。

2.2基因组提取

从金叉石斛幼叶中提取总基因组的方法使由默里和汤普森(1980)描述的，有些小修改。用紫外分光光度计测定了分离核酸的数量和纯度 (Perkin Elmer Lambda 35)。比在两波长的吸光度（A260和A280）是纯DNA的标准比，分离的基因数量被发现是最佳的进一步PCR扩增。

2.3 PCR优化的SCoT-PCR反应

总共有36个SCoT引物是由德国公司定制合成的，不同浓度的(i)模板DNA(20, 30,40, 50 and 60 ng),(ii)耐热性DNA聚合酶(0.5–2 U) 和 (iii)镁 盐(1–5 mM)被用来优化反应条件的聚合酶链反应。一旦建立了最佳条件，就对所有的基因型和引物进行扩增反应。所有的聚合酶链反应在25ul体积重进行包含50 ng的模板DNA，四中dNTPs各2uM，1times;PCR缓冲液10 mM Tris, pH 9.0, 50 mM KCl)，1.5 mM MgCl₂，1 U 的Taq聚合酶(Bangalore Genei, India) 和20皮摩尔的引物。反应程序是在在94°C下定为4分钟，包含在94°C下35个循环各30秒， 50 °C一分钟，72 °C两分钟。最后热循环仪2720在72°C延伸 5分钟(Applied Biosystems, USA)。扩增完成后，样品中加入了2.5ul的10times;蓝染料，并对样品进行了分析和研究，对扩增的DNA进行分析，以1.5%的琼脂糖凝胶搭配在1times;TAE缓冲在在65-70伏电压下3-4小时。脱氧核糖核酸片段在紫外光下观察并用凝胶成像系统进行采图(Biostep DH-20,Germany)。

2.4数据分析

带型SCoT的引物被编译成一个基于存在数据的二进制矩阵（1）或不存在（0）所选择的波段。只有清楚的、不含糊的和可重复的条带在这两种情况下会被认为是得到分数和数据，脏的和淡薄的条带会被排除在外。通过计算解析力来区分不同基因型的引物的能力(Prevost and Wilkinson, 1999)为 SCoT的引物。此功能已被发现与强烈的能力来区分基因型之间，和公式 Rp = Sigma;Ib条带在哪里的信息， Ib = 1 minus; (2 times; |0.5 minus; p|) 和P含条带I基因型的比例。多态信息量（图）值为使用公式PIC = 1minus;Sigma;Pi2计算，其中Pi是第i个等位基因频繁性（Smith et al.，1997）。遗传多样性参数包括多态位点百分比（Pp），Neis基因多样性（h），Shannon多样性指数（I）与软件1.31版本计算（Yeh et al.，1999）估计的遗传变异水平。基因流是从 Nm = 0.25 times; (1 minus; Gst) / Gst中预估而来，分子方差分析（AMOVA）采用Arlequin3.01版本进行（Excoffier et al.，2005）在两个层次上来研究在种群间和种群内的差异。固定指数或F统计量（FST）也与Arlequin 3.01节计算。这1000个随机排列的序列在人群中的意义进行了评价 (Miller, 1998)。成对的相似矩阵进行Jaccard相似系数的产生，使用类的SimQual格式(Rohlf, 1998)。一个系统树图构建使用非加权配对组法的算术平均(UPGMA) 和NTSYSpc类的SAHN模板，去显示一个数值表示遗传关系的相似系数 (Sneath and Sokal, 1973)。

1. 结果

3.1. SCoT-PCR

为研究金叉石斛的多态性，16个引物被用于研究SCoT中整个条带中。总共扩增的132个扩增产物中多态性有127个，96.15%表现出多态性。使用16个引物扩增产物在产生多态性条带范围从75到100% (表1)。底物 S4, S5, S6, S7, S9, S10, S12, S17, S25, S26,S32, S34, S35 和S36在分析中展现出了最高的水平，在所有引物中条带多样性达100% (Table 1; Figs. 2A and B)。扩增产物的平均数为8.25个每引物；最大为S10和S34的12号，而最小为S24的5号。对于SCoT的PIC值引物0.78。SCoT引物的RP范围从4.43（S25）7.50（S10），遗传距离记录使用的Jaccard系数的相似性为0.32～0.95 (表1)。

3.2种群结构

所观察到的等位基因数（钠）和有效数量的等位基因分别（NE）介于1.25至1.56和1.14至1.25之间。同样，Neis基因多样性（H）和Shannon信息指数（I）为0.08–0.15之间的0.28和0.13–0.24有一个总体的多样性，平均值分别是0.43。多态位点百分率（聚丙烯）的范围为25%至56.82%。基因流值和种群间的多样性分别被认为是0.37和0.57 (Table 2)。固定指数或F统计量（FST）为0.56。在人群的遗传特性和遗传距离Nei的措施也被计算

（表3；图S1）。AMOVA分析（P B 0.001）表明遗传变异（43.37%）在人群中观察到，而

种群间的变异率为56.63%（表4）。

3.3聚类分析

聚类算法得到的产生的 SCoT数据集，人口被分为三大集群(Fig. 2C)。第一，包括从梅加拉亚邦和锡金种群。第二，由来自阿鲁纳恰尔邦和锡金种群和第三，从那加兰和曼尼普尔邦的种群。

1. 讨论

尽管有巨大的园艺和药用价值，但可对金钗石斛遗传多样性的信息是非常有限的。目前有大量的石斛被用于花卉产业。因此，野生种质资源的育种计划的重要性不能被忽视。然而，栖息地破坏和过度开发是威胁着金钗石斛在印度的生存能力最重要的两个因素。迫切需要保护这一珍稀濒危类群。植物种群的遗传系统的使用作为一种工具，坚持几代人在一个不断变化的环境(Hatteme and Melchior, 1993)。鉴于此，有必要对评估物种面临着来自过度开采的威胁的植物的遗传多样性。

在与传统方法相比，基因指纹识别的遗传层次的遗传多样性与遗传多样性所需的可靠数据进行直接展现。相对的，该属的规模巨大，只有一小部分的石斛已经研究在分子水平上的遗传多样性，主要是基于其序列多态性(Burke et al., 2008; Tsai et al., 2004)。虽然王等人。（2009）报道31石斛属植物的系统发育收集来自中国郁南省，存在印度发现包括金钗石斛遗传多样性没有报告。揭示了金钗石斛从印度东北部收集的基因型之间的遗传多样性是对框架的开发重要的育种和种质保存策略的重要一步。

SCoT技术是低水平的遗传变异非常敏感从而提供了一个非常有用的工具，用于分析人口遗传学，在广泛的植物，以及确定物种或种群为同一物种(Collard and Mackill, 2009)。在目前的研究中，代表属的金钗石斛来自印度东北部的不同地方的植物仍然可以在自然中发现，

利用16个SCoT引物指纹图谱对其进行了不同生境的鉴别。SCoT技术的本研究中的疗效是由得到的照片和分析所使用的引物RP值进一步支持。SCoT标记系统的PIC值为0.78

和反相值介于7.50和4.40，这是在同最佳粒子和反相值(Prevost and Wilkinson, 1999; Smith

et al., 1997)。这2个参数提供一个基准，有助于确定所使用的引物的有效性的指纹识别

过程因于独创性的技术。

准确估计的是重要的保护珍稀植物遗传多样性 (Nongrum et al., 2012; Zhang et al., 2005)。一个较小到更高水平的遗传多样性已被报道于濒危兰花，即，高斑叶兰，独花兰，天麻和中联蓝花 (Li and Ge, 2006; Manners et al.,2013; Wong and Sun, 1999; Wu et al., 2006)。在本研究中，通过分析揭示了存在一个更高的分布，种群间的遗传变异（56.63%）相比，withinpopulations（43.37%）金钗石斛也支持通过GST值。李和葛（2006）也发现了适度的遗传分化C.兰种群，中国珍稀濒危兰花。植物遗传变异的分布格局受各种生活史特征，有着特别的育种体系显著效果(Bussell, 1999; Nybom and Bartish, 2000)。

花粉和种子是其他兰花基因流的有效模式(Ding et al., 2008)。在本研究中，预计的基因流被发现很低（纳米= 0.37）。人口的地理隔离是一个金钗石斛的基因流低的可能原因，因为他们的成长主要是在山地森林以及长满青苔的灰岩，海拔800至2000米。此外，它是传粉昆虫飞越困难高山屏障，使种群间的花粉转移(Wong and Sun, 1999)。另外，在大多数兰科植物有种子发芽率低，这可能也有助于较低的基因流。丁等人（2008）在石斛的情况下发现了濒危兰科石斛类似的结果。

这是从印度东北部利用SCoT标记系统金钗石斛遗传多样性的研究。基于SCOT法本研究显示更高的遗传多样性种群内的遗传多样性种群间但温和。因此，从东北印度的制定识别遗传多样性野生种质资源的收集和维护中，将是这一濒危类群非常重要的保护策略。作为一种名贵药材，属濒危，金钗石斛特别值得保护的关注。保护的最终目标是确保种群的持续生存与维持进化的物种潜能(Wong and Sun, 1999)。大多数兰花物种包括金钗石斛有较强的生境选择和授粉的依赖(IUCN/SSC Orchid Specialist Group, 1996)。因此，保护栖息地将确保物种与其他生物共存，像真菌和授粉的兰花取决于其生命周期的完成 (Li and Ge, 2006)。本研究表明那苏格兰标记系统可用于评价遗传关系，最终将有助于表征其他濒危物种属于家庭兰科。

lt;

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

英语原文共 6 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[286599]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word