Aldo-keto还原酶（AKRs）的速率决定步骤对人类甾体5β-还原酶（AKR1D1）的研究外文翻译资料

Aldo-keto还原酶（AKRs）的速率决定步骤对人类甾体5beta;-还原酶（AKR1D1）的研究

摘要:醛酮还原酶（AKR）是NAD（P）（H）依赖性氧化还原酶的扩展族,其催化多种内源和外源底物上的羰基或alpha;，beta;-不饱和酮的还原。这些酶催化顺序有序的双 - 双动力学机制，其中辅因子首先被结合并最后被释放。使用人类甾体5beta;-还原酶（AKR1D1）作为代表性酶，先前已经确定了底物结构对AKR催化的限速步骤的影响。当在AKR1D1的单次更新实验中使用不同的类固醇底物时，发现化学步骤的速率相差两个数量级。这种差异反映在多次周转实验中。C ₁₇ –C ₂₁类固醇底物表现出快速的化学步骤，然后缓慢的产物释放，如“爆发”相动力学所示。相比之下，C₂₇类固醇具有较慢的化学步骤，决定了反应速率，并且不再观察到“爆发相”动力学。在这里，我们提出单周转动力学实验，并发现由于它们的双相性质，它们支持快速底物存在两种不同的结合姿势。我们还重新解释了多次转换实验中“爆发相”动力学的丧失，因为类固醇侧链与类固醇袋的远端部分相互作用的长程效应扰乱了氢化物转移的反应轨迹，从而减少k _cat。作为一般现象，讨论了类固醇结构的能力以及因此结合姿势影响类固醇转AKR中的速率确定。

关键词：预稳态动力学; 氢化物转移; 辅因子释放; 胆汁酸; 类固醇激素

1 引言

醛酮还原酶（AKR）是NAD（P）（H）依赖性氧化还原酶的超家族，其催化羰基向其相应的醇或alpha;，beta;-不饱和酮还原为其相应的烷酮。AKR存在于生命的所有领域，并且基于序列同源性分为16个家族。它们参与各种内源性底物的代谢，包括糖，脂质，视网膜，类固醇和前列腺素以及异生素如二羰基和化学致癌物质代谢物，例如多环芳烃反式二氢二醇。已经在人类中鉴定了15个AKR成员，其中许多成员属于AKR1家族。人类AKR起醛还原酶，醛糖还原酶，类固醇转化酶，电压门控依赖性钾通道的beta;-亚基和黄曲霉毒素醛还原酶的作用。

AKR1D是一个独特的亚家族，代表类固醇5beta;-还原酶。它们催化立体特异性不可逆双键还原而不是羰基氧化还原。人类酶AKR1D1代谢所有胆汁酸前体和含有该Delta;类固醇激素⁴ -3-酮的不饱和A环的功能。该反应对于胆汁酸成熟是必需的，其导致形成初级胆汁酸，鹅去氧胆酸和胆酸。这些胆汁酸由于其类似洗涤剂的特性而乳化膳食脂肪和亲脂性维生素，并在7alpha;-羟化酶水平下引起胆汁酸生物合成的正反馈抑制。5beta;-还原对于类固醇激素代谢也很重要。它产生生理活性的5beta;-类固醇，参与神经传递，红细胞生成和分娩，并通过形成四氢类固醇用于结合引发类固醇清除。

与所有其他AKR家族成员一样，AKR1D1是一种37kDa的胞质单体蛋白，具有特征性（alpha;/beta;）₈磷酸丙糖异构酶桶核心结构。活性位点位于beta;-链的C-末端，具有形成配体结合位点的长柔性环。AKR1D1被认为遵循顺序有序的双向动力学机制，其中NADPH首先被结合并且NADP 离开了。该假设基于与其他AKR的序列同源性，以及在没有类固醇的情况下辅因子与AKR1D1结合但不反之亦然的动力学和晶体学证据。在AKR催化中，辅因子结合和释放通常伴随着特征性缓慢步骤的构象变化，而化学步骤的速率可以根据底物而显着变化。反应的转换数ķ_猫表示催化期间最慢的限速步骤，这可以改变取决于的化学步骤，产品和辅因子释放步骤的相对速率。由于反应条件的变化，这有时会导致不同研究之间的结果不一致。

首先将重组AKR1D1纯化至同质性并由我们系统地表征。所述酶能够减少各种类固醇底物，包括的C的C₁₈，C₁₉，C₂₁，和C₂₇只要系列作为alpha;，beta;不饱和Delta; 4-3-酮部分存在于类固醇A-环。稳态动力学测量揭示了不同类固醇底物的转换数（k_cat）的显着差异，这取决于结构，尤其是C17侧链的长度。例如，C₂₁具有较短侧链皮质类固醇是最快的底物AKR1D1之间，而C₂₇具有较长侧链胆汁酸前体是最慢的底物。在差分ķ _猫可的松和胆甾烯酮之间的值是20倍。该观察结果表明在速率确定步骤中发生了显着变化。我们之前报道了一项瞬态动力学研究，以检验这些差异的基础。

2 材料和方法

所有类固醇均得自Steraloids（Wilton，NH，USA）。吡啶核苷酸购自Roche Applied Science（Indianapolis，IN，USA）。所有其他试剂购自Sigma-Aldrich（St.Louis，MO）并且是ACS（美国化学学会）等级或更好。

2.1单次周转实验

所有停止流动实验均在Applied Photophysics SX.18和SX.19MV阻流分光光度计（Leatherhead，UK）上进行。将AKR1D1与化学计量的NADPH预温育，以形成E·NADPH复合物。在与类固醇溶液混合时开始反应。典型的反应在含有4％乙腈作为共溶剂的100mM磷酸钾缓冲液（pH7.0）中含有1.0mu;MAKR1D1,0.8mu;MNADPH和35mu;M类固醇。根据反应速率，通过荧光测定法（lambda;_激发= 340nm，lambda;_发射= 450nm）监测进展曲线20-1000s。曲线拟合为单指数（方程1）或双指数方程（方程2）），其中y是荧光信号，A，A₁和A₂是幅度，a是截距，k_obs是化学步骤的速率常数。

y = A exp（ - k _obs t） a

（等式1）

y = A ₁ exp（ - k _obs1 t） A ₂ exp（ - k _obs2 t） a

（等式2）

2.2多次周转实验

将AKR1D1与饱和量的NADPH预孵育，然后与类固醇底物混合以引发反应[ 9 ]。典型的反应在含有4％乙腈作为共溶剂的100mM磷酸钾缓冲液（pH6.0）中含有2.5mu;MAKR1D1,18mu;MNADPH和25mu;M类固醇。通过荧光测定法（lambda;_激发= 340nm，lambda;_发射= 450nm）监测进展曲线20-100s并且拟合为“爆发”（等式3）或线性等式（等式4），其中k _突发是速率。对于指数“突发相位” 恒定，并且k_ss是线性稳态阶段的速率常数。

y = A exp（ -k _burst t） k _ss [E] t a

（等式3）

y = k _ss [E] t a

（公式4）

对于代表性的快速底物可的松和慢速底物7alpha;-羟基胆甾烯酮，在一系列类固醇浓度下进行实验。k_突发和k_ss的次要图与[S]显示饱和动力学并且拟合为双曲线方程（方程式5），其中k个_{突发/ ss}可以是k _突发或k _ss，k _lim是限制速率常数，并且K_1/2是表观半饱和常数。

k _{burst / ss} = k _lim [S] /（K _1/2 [S]）

（等式5）

2.3NADP 释放率

使用配体追踪实验测定来自AKR1D1的NADP 的解离速率常数。NADP 从AKR1D1bull;NADP 络合物（1mu;MAKR1D1和5mu;MNADP ）的位移大过量NADPH（50mu;M），在100mM磷酸钾缓冲液（pH 6.0）的，含有4％乙腈作为共溶剂。通过停流仪器上的能量转移带（lambda; _激发 = 295nm，lambda;_发射= 450nm）的增加来监测E·NADPH复合物的形成。将动力学轨迹拟合为单指数方程（方程式1）。

3 结果

3. 1. AKR1D1的限速步骤受类固醇底物的影响

瞬态单次转换实验显示k_chem的变化稳态实验表明，不同类固醇底物的转换数量有20倍的变化。为了调和这些数据，使用预稳态动力学解剖了AKR1D1对5beta;-还原的动力学机制。使用单次转换实验来测量化学步骤（k_chem）的速率，其通过氢化物转移和质子供给来定义。检查了六种不同的类固醇底物。在我们的设置中，酶浓度保持等于或略高于辅因子浓度，以限制对第一次转换的反应。通过跟踪NADPH荧光的消失获得类固醇减少的进展曲线。在类固醇底物的饱和浓度下，动力学痕迹可分为两组。

一组最适合双指数方程，表明两个酶活性群参与化学步骤。酶稳定性或辅因子状态不能很容易地解释双相行为。快速相位k _obs1的速率常数为1.27至_0.119s ^-1，比0.128至_0.0176s ^-1的慢相位k _obs2高5至10倍。该组中的类固醇与稳态中具有较高转换数的那些类似，例如醛固酮，可的松，睾酮和皮质酮。

第二组最适合单个指数方程。该组中的类固醇是较慢的底物，例如7alpha;-羟基胆甾烯酮和胆甾烯酮。7alpha;-羟基胆甾烯酮和胆甾烯酮的速率常数分别为0.00523和0.00133s ^-1。如果来自两组的动力学轨迹被强制拟合到双指数方程，则显然快速和慢相的速率与类固醇的转换数相关。由这些瞬变的振幅指出的两相的比例取决于特定的类固醇底物。使用最快的基质醛固酮，快速相（A₁）的振幅约占总信号的50％（甲_总）（表1）。当使用较慢的衬底时，由快速相表示的振幅的分数减少。速率常数k_obs1和快速相的振幅继续下降，直到最慢的底物7alpha;-羟基胆甾_烯酮和_胆甾烯酮不能很好地区分两个相（图1C）。

尽管观察到快速底物的双相行为，但快速和慢速底物之间化学速率的显着差异是显而易见的。即使选择快速基质的较慢相用于比较，在最快的底物醛固酮（0.128s ^-1）和最慢的底物胆固醇（0.00133s ^-1）之间的k _obs

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