蛋白质在昆虫睾丸中表达并与精子相互作用——BMC发育生物学外文翻译资料

英文翻译A

Research article

Yolk protein is expressed in the insect testis and interacts with sperm

Piotr Bebas^dagger;1,2, Joanna Kotwica^dagger;1, Ewa Joachimiak¹ and Jadwiga M Giebultowicz*²

蛋白质在昆虫睾丸中表达并与精子相互作用——BMC发育生物学

雄性和雌性配子遵循不同的发育途径, 由它们在受精中的不同作用决定。在卵母细胞的卵母细胞积累卵黄的同时, 精子在个体化过程中会脱落大部分细胞质。从睾丸中释放的哺乳动物精子在涉及多种糖蛋白的精管中进行了广泛的修饰。超微结构研究表明, 糖蛋白参与了昆虫精子的成熟;然而, 它们在分子水平上的表征是缺乏的。我们之前的报告, 生物钟控制精子的释放和成熟的几个昆虫物种。在飞蛾中 , 糖蛋白分泌到中 , 呈每日节律模式。本研究的目的是描述该物种糖蛋白 , 阐明它们在精子成熟过程中的作用。

我们收集了男性每日精子释放前后的蛋白。用二维凝胶电泳分离这些样品, 用糖蛋白检测探针对凝胶进行处理。我们观察到在精子释放后采集的样本中含有一组丰富的糖蛋白, 而在精子释放前采集的样本中没有糖蛋白。通过质谱对这些糖蛋白进行测序, 揭示了与蛋黄成分同源的肽, 据悉, 蛋黄细胞在卵母细胞的发育过程中积累。西方印迹证实了这一意想不到的结果 , 表明中含有蛋白质免疫反应的抗体对卵黄蛋白 yp2 产生的卵泡细胞周围的发展卵母细胞。我们克隆了来自利托拉利斯的 ip2 cDNA 片段, 并确定它在卵巢和睾丸中都有表达。在睾丸内包裹精子的体细胞细胞中检测到 yp2 mRNA 和 YP2 蛋白。在精子释放期间 , YP2 蛋白出现在中 , 并在精子上形成外皮。

结论 : 在雌性卵母细胞中积累的蛋黄蛋白前体 YP2 中 , 似乎有一个外皮。男性特有的第二个角色。它在睾丸中产生 , 并释放到中 , 在那里它与精子相互作用。这些数据揭示了昆虫卵和精子成熟的意外共同因素。

背景

雄性和雌性的生殖细胞细胞分别在成为具有受精能力的精子或卵母细胞之前经历了复杂的成熟过程。 在其发育的最初阶段，种系干细胞被体细胞包裹; 两种细胞类型在配子成熟过程中广泛相互作用。 在昆虫中，发育中的卵母细胞周围的细胞称为卵泡细胞，而包裹分化精子克隆的细胞称为囊肿细胞。

卵泡细胞具有多种功能; 它们保护和滋养正在生长的卵母细胞，控制绒毛膜的形成，并参与卵的空间模式[1]。 卵泡细胞在卵黄发生中也起重要作用。 它们产生卵黄蛋白（YP）前体，其在成熟卵母细胞的卵黄球中积累。 此外，卵泡细胞控制卵母细胞对脂肪体产生的卵黄蛋白（卵黄蛋白原）的摄取[2]。

与卵泡细胞相比，它们在昆虫睾丸（囊肿细胞）中的体细胞等价物的功能知之甚少。 囊细胞围绕每个精原细胞的创始细胞，并继续包裹分化的精母细胞和延长的精子细胞[3,4]。 在较高的昆虫中，发育中的精子在精子束中排列[5]。 在睾丸释放期间，精子从囊肿细胞中释放出来; 后者似乎经历相邻睾丸上皮细胞的破碎和吞噬作用[6-8]。从睾丸释放的精子经过进一步的成熟以获得受精能力。已经在哺乳动物中广泛研究了精子睾丸外成熟的过程。已经发现，从支持细胞和生殖道上皮细胞释放的许多糖蛋白参与精子成熟并促成精子上形成的细胞外膜 [9-11]。对几种飞蛾物种的超微结构研究表明, 昆虫精子在从睾丸中释放后获得细胞外膜[12, 13];然而, 涂层成分还没有被生化鉴定出来。飞蛾头颅是特别适合研究睾丸外精子成熟, 因为这个物种的男性释放几百个精子束每天从睾丸进入上输精管 (UVD) [14]。精子在这和其他飞蛾中的释放是由生物钟控制的, 发生在16h 光的黑暗阶段开始后的几个小时内: 8小时黑暗光周期 [14, 15]。精子释放到 UVD 与生理时钟控制的酸化和糖蛋白丰富颗粒分离到 UVD [ 16 , 17 ] 。目前研究的目的是在精子释放时识别 UVD 中的糖蛋白。值得注意的是，来自最显着的糖蛋白的肽显示出与来自几种蛾类的雌性蛋黄成分的同源性。 此外，在雌性卵泡细胞中产生的抗卵黄蛋白YP2的抗体[18,19]免疫检测雄性精液中的单一蛋白质。 然后我们克隆了来自S. littoralis的yp2 cDNA片段，并确定它在卵巢和睾丸中均有表达。 我们提出证据表明YP2蛋白在雄性囊肿细胞中产生并与释放到UVD腔中的精子相互作用。结果

S. littoralis的精液含有与卵黄蛋白具有同源性的糖蛋白

从蛾睾丸释放到上输精管（UVD）的腔中的精子束浸泡在精液中。 我们之前报道过 - 与精子释放同时发生 - 几种糖蛋白被分泌到蛾蛾的UVD精液中[17]。 为了表征精液蛋白，在点亮（白天样品，精子释放前）和熄灭后4小时（夜间样品，精子从睾丸释放后）后4小时从雄性中分离出UVD。 收集来自白天和夜晚样品的UVD流明的含量，并通过温和离心将夜间样品中存在的精子与半液体分离。 通过2-D凝胶电泳分离精液中含有的蛋白质，并将凝胶与糖蛋白检测染色剂一起温育。

染色显示夜间样品中一组显着的三个蛋白质，分子量约为75 kDa，在当天样品中不存在。 （图1，箭头1-3）。 从凝胶中切下三个蛋白质点并消化成肽，通过Q-TOF质谱联用纳米HPLC系统分析。 蛋白质斑点No.1和2产生五种与来自几种鳞翅目的卵黄成分同源的肽，而斑点3不产生这样的肽。为了验证精液中确实存在与卵黄有关的物质，来自UVD腔的蛋白质通过1-D电泳分离，转移到膜上，并用针对各种昆虫蛋黄蛋白的可用抗体进行探测。 我们测试了从蛾，Plodia interpunctella [18]识别单个卵黄蛋白YP1，YP2，YP3和YP4的抗体，以及识别来自黑腹果蝇的三种卵黄肽（YP1，YP2和YP3）的抗体[20]。 在这些抗体中，只有特异性识别P.interpuncella [18]的YP2的一种抗体与S. littoralis的精液中的约75kDa的蛋白质免疫反应（图2）。 这种抗体染色的蛋白质条带在卵巢和P. interpunctella的睾丸-UVD复合物中具有相似的大小; 在这些器官中检测到约80kDa的额外染色（图2）。 S. littoralis的免疫染色

图1

Spodoptera littoralis的UVD精液中的糖蛋白检测。 通过2-D凝胶电泳分离从UVD腔获得的蛋白质，并用Pro-Q Emerald 300 Glycoprotein Gel Stain进行探测。 黑色箭头表示最丰富的糖蛋白斑点，等电点（pI）在6和7之间（编号1-3）。

这些蛋白质进行了质谱分析，在蛋白质＃1和＃2中检测到几种与蛋白质同源的肽，这些蛋白质在卵母细胞中形成蛋黄质。

图2

蛋黄质交叉反应物质存在于男性生殖道中。 针对来自P.interpunctella的YP2抗血清的蛋白质印迹在S. littoralis（泳道1）的精液中检测到~75kDa的单个蛋白质条带，并且在P.interpuncella testis-UVD的提取物中检测到75-80kDa的多个条带。 复合物（泳道2）和卵巢（泳道3）。 在Western印迹之前，当用P.intermpunctella卵巢组织预吸收抗体时，S.lototoralis精液中的信号减少（泳道4）。 在每个泳道中加载等量的总蛋白质提取物（1OD）。

获得的S.lotoralis的cDNA序列用于设计用于扩增660bp的特异性引物

cDNA产物。 使用这些引物，我们获得了cDNA

来自S. littoralis的卵巢和睾丸 - 输精管复合体的预期大小，但不是来自其他组织的

当用固定的P. interptuncla卵巢预吸收的YP2抗体探测印迹时，精液急剧减少，这表明S. littora-lis的精液确实含有YP2免疫反应物质（图2）。化鉴定出来。飞蛾头颅是特别适合研究睾丸外精子成熟, 因为这个物种的男性释放几百个精子束每天从睾丸进入上输孔 (UVD) [14]。精子在这和其他飞蛾中的释放是由生物钟控制的, 发生在16h 光的黑暗阶段开始后的几个小时内: 8小时黑暗光周期 [14, 15]。精子释放到 UVD 与生理时钟控制的酸化和糖蛋白丰富颗粒分离到 UVD [ 16 , 17 ] 。目前研究的目的是在精子释放时识别 UVD 中的糖蛋白。引人注目的是, 从最突出的糖蛋白中提取的肽与几种飞蛾的雌性蛋黄成分呈同源性。此外 , 对卵黄蛋白 YP2 的抗体 , 它是在女性卵泡细胞 [ 18 , 19 ] 中产生的免疫检测到男性中的单一蛋白质。然后, 我们克隆了来自利托拉利斯的 ip2 cDNA 片段, 并确定它在卵巢和睾丸中都有表达。我们提供的证据表明, YP2 蛋白是在男性囊肿细胞中产生的, 并与释放到 UVD 腔中的精子相互作用。从飞蛾睾丸进入上输精管 ( UVD ) 的腔中 , 沐浴在中。我们以前的报告是 - - 与精子释放同时发生 - - 几种糖蛋白被分泌到飞蛾的 UVD 中 [ 17 ] 。为了表征蛋白 , Uvd 在开光 4 小时后 ( 白天样本 , 精子释放前 ) 和关闭后 4 小时 ( 夜间样本 , 睾丸释放后 ) 与男性分离。采用温和离心法, 采集了昼夜样品中 UVD 流明的含量, 并将夜间样品中存在的精子从半液中分离出来。采用二维凝胶电泳法测定中的蛋白质 , 用糖蛋白检测染色培养凝胶。染色显示了一个突出的组三个蛋白, 分子量约 75 kDa 的夜间样本, 在白天的样本中不存在。(图 1, 箭头 1–3)。将这三个蛋白质斑点从凝胶中去除, 消化成多肽, 用 Q-TOF 质谱结合纳米高效液相色谱体系对其进行分析。1号和2号蛋白质点产生了几种来自几种舌翅目动物的与蛋黄成分同源的五肽, 而第3点没有产生这种肽。流明通过一维电泳进行镇静剂分级, 转移到模氏蛋白, 并利用针对各种昆虫蛋黄蛋白的有效抗体进行研究。我们测试了从飞蛾、皮卡特拉 [18] 中识别个体蛋黄蛋白 YP1、YP2、YP3 和 YP4 的抗体, 以及从果蝇中识别三个蛋黄肽 (YP1、YP2 和 YP3) 的抗体 [20]。在这些抗体中 , 只有一个专门识别 p . intert 名叫 [ 18 ] 的 yp2 的抗体在荔枝中具有约 75 kDa 的蛋白质反应 ( 图 2 ) 。这种类似大小的抗体染色蛋白带在卵巢和睾丸 uvd 复合物中;在这些器官中检测到约 80 kDa 处的额外染色 (图 2)。移植物第2页12页的免疫保存 。

在下一个实验中，我们询问YP2是否在S. littoralis雌性中作为卵黄蛋白发挥作用，类似于P. interteruncla [18]。 用YP2抗体进行蛋白质印迹检测卵巢提取物中的单个蛋白质条带，但未检测到S. littoralis雌性的脂肪体。 卵巢蛋白与精液中的免疫阳性蛋白大小相同（图4A）。 然后使用YP2抗体染色含有成熟卵母细胞的卵巢S.oleoleles卵巢。 在卵黄发生的卵母细胞和卵泡细胞中检测到强的和特异性的YP2信号（图4B-C）。 这些数据表明，我们首次在雄性精液中鉴定出的YP2蛋白是S. littoralis雌性中的卵黄成分。 由于在脂肪体中未检测到YP2（图4A），它似乎仅在卵黄发生的卵母细胞周围的卵泡细胞中产生，类似于P.interpunctella [19]。

YP2蛋白质和mRNA在雄性生殖系统中的分布

UVD精液含有来自两个来源的蛋白质：睾丸和UVD分泌上皮。 为了确定精液中YP2蛋白的来源，我们通过Western印迹用YP2抗体探测睾丸和UVD壁的匀浆。 此外，我们检测了UVD后生殖道的部分：精囊（SV），精子储存双相和射精管。 我们还测试了血淋巴，飞行的肌肉和脂肪体，以确定是否存在YP2。 在UVD精液的提取物中再次检测到约75kDa的单一免疫反应蛋白条带（图5）。 UVD壁的提取物含有约80kDa的免疫阳性条带。 在整个睾丸的提取物中观察到强的免疫反应性，分子量在75和80kDa之间。 我们没有在精囊，血淋巴，肌肉或脂肪体（图5），精子储存双相或射精管中检测到大量的YP2免疫阳性物质（数据未显示）。

生殖系统中YP2免疫阳性物质的空间分布通过免疫细胞化学（ICC）测定，其中YP2抗体在输精管 - 输精管复合物的切片上。 YP2强烈染色包裹精子束的囊肿细胞的细胞质（图6）。 与其他鳞翅目一样，S。littoralis产生有核和无核精子[23]。 囊肿细胞包裹两种类型的精子束特异性染色YP2，而囊肿内的精子似乎未染色（图6 A-B）。 除了睾丸囊肿细胞外，UVD上皮壁的切片显示出扩散但特异性

用YP2抗体染色（图6C-D）。 相反，精囊壁是免疫阴性的（图6E-F），与Western印迹的结果一致（图5，第5行）。

在囊肿细胞和UVD上皮细胞中检测到YP2样物质后，我们询问yp2基因是否在两种细胞类型中都有表达。 从囊肿细胞封闭的睾丸精子束，UVD壁和卵巢（作为控制）中分别提取总RNA。 使用yp2特异性引物进行RT-PCR反应。 从卵巢和睾丸精子束获得预期大小（660nt）的PCR产物，但不从UVD上皮壁获得（图7A）。 该数据表明yp2基因在UVD细胞中不表达。 为了确定UVD上皮细胞中YP2-免疫阳性物质的来源，在睾丸和UVD之间系上细丝线，防止精子和其他物质从睾丸中释放。 在处理后8小时解剖来自实验和对照假手术的雄性的复制系统，固定切片并用YP2抗体染色。 YP2免疫染色存在于与睾丸保持连接的对照UVD的上皮细胞中。 相反，从睾丸分离的UVD在上皮细胞中未显示Y

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