Islet-1在内分泌胰脏成熟，增殖和存活中不可缺少

Aiping Du,¹ Chad S. Hunter,² Johanna Murray,¹ Daniel Noble,¹ Chen-Leng Cai,³ Sylvia M. Evans,⁴ Roland Stein,² and Catherine Lee May^1,5,6

目的-胰腺发育过程中的成熟细胞类型的产生取决于许多调节和信号蛋白的表达。在这项研究中，我们测试了转录调节因子胰岛-1（Isl-1），其表达首先在显影胰腺的间质和上皮检测到之后仅限于成熟胰岛细胞，参与了终末分化的假说的胰岛细胞和胰岛质量的维持。

研究设计和方法-探讨Isl-1在胰腺上皮二级转变过程中的作用，ISL-1利用Cre/ LoxP技术从13.5天胚胎条件性敲除。

结果-

结论-这些结果表明

脊

椎动物胰腺保持营养体内平衡是至关重要的。胰腺外分泌的由隔间,腺泡和导管组成的细胞分泌和运输消化酶进入十二指肠,和内分泌室组成的胰岛产生激素调节葡萄糖代谢。每个胰岛包含五个细胞类型: alpha;,beta;，delta;，ε，和PP细胞表达胰高糖素的激素,胰岛素,生长激素抑制素、胃饥饿素,胰多肽,分别（1-4）

内分泌胰腺的发育在小鼠胚胎发育的两个阶段发生（5）。在胚胎期（E）9.5的主要转变是由肠内胚层上皮生长进入周围的内脏中胚层形成背部和腹部的胰腺芽标记。在此期间，第一波胰高血糖素的集群和或胰岛素细胞似乎从胰腺上皮出芽。然而，细胞缺乏功能性相关的关键蛋白alpha;和beta;细胞，并不认为是构成成年胰岛（3,5）。激素的一个显着第二波？细胞周围E13.5 E15.5到胰腺上皮脱层;这些细胞增殖并成熟成胰岛细胞（6,7）。胰岛结构在出生不久后形成最终组织（6）。

对于小鼠功能获得型突变和功能缺失型突变的研究已经解释转录因子在内分泌胰腺发育中的重要性。虽然在内分泌细胞发育的多个阶段不可缺少一些转录因子，其他都需要在胰岛细胞形成（8）的特定网络连接C阶段。例如，神经元素3（Ngn3的）是内分泌细胞特定网络阳离子的表达是所有内分泌细胞的发育（9,10）必不可少的一个中心调节。然而，许多转录因子是对早期胚胎存活必不可少的;因此，在小鼠组织特定网络C基因敲除的战略是需要发现它们的功能在后期的发展。例如，Foxa2的缺失小鼠因为内分泌细胞分化和胰岛细胞功能节点和脊索（11,12），和特异性ccedil;角色畸形发展的原肠胚形成后不久死亡只透露使用组织系数网络C基因消融的方法（13-16）。同样，泛内分泌转录因子的Pax6的胚胎和出生后的角色，分别只有当Pax6的空和有条件的小鼠进行了研究鉴定连接（17,18）。与此相反的Pax6，MAFB，在发育中表达alpha;和beta;细胞，需要的细胞成熟（如激素基因表达），但不是细胞特定连接阳离子（19,20）。另一方面，MafA的唯一胰岛素表达在啮齿类动物的二次转换的细胞；然而，MafA的小鼠无明显发育缺陷的可能是因为MafB（21-23）的补偿。

像的Pax6，泛内分泌细胞转录因子，胰岛-1（Isl-1）在中枢神经系统的发育，心脏中胚层和胰腺中表达，并且是用于这些器官（24-27）的分化至关重要。不幸的是，Isl-1空胚胎死于因心脏缺陷形成E10.5;因此，目前还不清楚，是否ISL-涉及的次级转变（24-26）期间建立的胰腺内分泌细胞。然而，ISL-1缺失的小鼠表现出胚胎背侧胰芽受损发生和胰高血糖素缺乏胰岛素或者生长抑素？细胞在体内或体外（24）培养突变体胰外植体之后。

为了克服Isl-1缺失动物的早期致死我们已经得出小鼠具体来说缺乏胰腺上皮这个因素二次转型过程中审查在其胰岛细胞发育中的作用。我们表明从E13.5胰腺上皮Isl-1的缺失导致激素表达细胞严重减少和胰岛质量的最终损失。我们证明了Isl-1控制在产后胰腺细胞增殖和内分泌细胞的存活。此外，降低胰岛素基因转录和beta;细胞功能似乎从MafA的基因转录一个特定的ccedil;缺陷，这是我们确定为直接Isl-1的目标至少部分导致。这些结果表明在与二次过渡后ISL-1在生产内分泌激素和内分泌细胞块的维护的重要性。

研究设计和方法

动物育种方法。曾经报道（28,29）在Isl-1^Loxp位的推导和Pdx1-Cre转基因。所有小鼠被安防在一个混合的远交CD1背景。Pdx1-Cre；Isl-1^L/ 和Isl-1^L/L小鼠交配出Pdx1-Cre；Isl-1^L/L突变小鼠。在我们的检测控制中同窝出生的Isl-1^L/L，Isl-1^L/ 和Pdx1-Cre；Isl-1^L/ 重组和来自混合CD1 Isl-1 ^/ 没有区别。动物实验是由费城的机构动物护理和使用委员会的儿童医院批准。

葡萄糖耐量试验和分析程序。禁食过夜动物用每体重公斤2克葡萄糖（Sigma）的腹膜内注射。血糖值在监测0，15，30，用自动血糖仪在注射后60,90和120分钟（One Touch Ultra; LifeScan公司）。制备血浆，血液收集在肝素化管（BD Microtainer），纺丝，并在〜80℃下贮存，直到进行分析。血浆胰岛素水平使用Luminex公司试剂盒（Linco）进行测定。总胰腺胰岛素和胰高血糖素含量进行酸乙醇提取物的放射免疫宾夕法尼亚糖尿病中心的大学评估。

免疫荧光FL/免疫组化。将组织网络连接在4％低聚甲醛（PFA）在4℃过夜固定的再嵌入任一石蜡或最佳切割温度冷冻介质。幻灯片（8-10 M 切片）进行微波抗原修复在10毫摩尔/升柠檬酸缓冲液（pH6.0的），并阻断与蛋白封闭试剂（Immunotech公司）。载玻片用初级抗体孵育在4℃下过夜，加入在室温下2小时适当的二级抗体。以下主要抗体：胰高血糖素（1：3000;凌嘉），胰岛素（1：1000;凌嘉），促生长素抑制素（1：3000;圣克鲁斯），胰多肽（1:50; Zymed公司），生长素释放肽（1：200 ;圣克鲁斯），ISL-1（1:50;发育研究杂交瘤细胞银行39.4D5和40.2D6）的Pax6（1：500;科文斯），MafA的（1：1000; BETHYL实验室）和Pdx1的（1：200;圣诞老人）。 Ngn3的（1：500;发育研究杂交瘤库），的Cy2，Cy3标记，和Cy5缀合的二抗（1：600;杰克逊免疫研究）。发育研究杂交瘤细胞银行ISL-1单克隆抗体儿童健康和人类发展研究所的主持下开发和爱荷华州，生物学系的大学（衣阿华市，IA）保持不变.

RNA分离，cDNA合成和实时PCR反应。使用RNA简易试剂盒（Qiagen）从匀浆胰腺提取总RNA。使用1微克的Oligo（dT）引物，标II反转录RNA的反转录，和伴随试剂（Invitrogen）中。实时PCR反应设置使用灿烂的SYBR Green PCR预混液（Stratagene公司）。所有反应均在参考染料归一式三份进行，并用于分析中位数循环阈值。引物序列可根据要求提供。

测量beta;细胞质量。胰腺被拆除，称重，固定的4％PFA在4℃过夜，并嵌入石蜡。切片（8-10米）与最大足迹被用于胰岛素染色。图像在4取？放大倍数和胰腺组织积极为胰岛素染色用IP软件实验室测量。通过测量胰岛素阳性染色总横截面面积的部分和由胰腺重量相乘得到的beta;细胞质量。一个部分被每胰腺使用具有至少四个控制和在每个时间点分析突变小鼠。

PAX6细胞激素细胞定量。用Pax6的免疫染色检测后期内分泌祖细胞（激素 或激素^-（30）;个人激素免疫组化染色被用来纪念成熟的内分泌细胞亚型。使用IP实验室软件测定胰截面积。在E15.5（n=6），分别选择具有最大胰足迹的两个相邻的部分。PAX6 细胞计数，并将结果标准化为截面积。要衡量内分泌细胞亚型的分化，激素表达细胞的数目表示相对于Pax6 的细胞数量。用同样的方法来测量在E18.5内分泌细胞亚群（n=3），不同之处在于，取平均值的七点部间隔通过块取10个部分。在P4（n=4），Pax6 细胞在四个部分进行计数并归一化到胰腺截面积。

转移酶介导的缺口末端标记和溴脱氧尿苷检测。凋亡率被转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）使用ApopTag过氧化物酶原位凋亡检测试剂盒（Chemicon公司）染色评估。切片处理为TUNEL测定，以及相邻的切片用抗Pax6的抗体。TUNEL 的百分比被除以TUNEL 数产生内分泌细胞Pax6 的数量。胰岛素染色的切面作为TUNEL 法找到胰岛进行。对于溴脱氧尿苷（BrdU）标记检测，怀孕的动物（E18.5）和幼崽用10？L / G BrdU标记试剂（Zymed公司）注入并杀害6小时后。的BrdU染色用的BrdU染色试剂盒（Invitrogen公司）进行。切片用BrdU标记的抗体，并且相邻的切片用抗Pax6的抗体。的BrdU的百分比是多少？被分割的BrdU的数目产生内分泌细胞？细胞进入Pax6的多少？ 细胞。胰岛素染色的同一部分的BrdU染色定位胰岛进行。至少2000 Pax6 细胞计数每个动物为TUNEL和BrdU实验和Pax6 用于归一化的细胞。

电泳迁移率变动分析。PCS2鼠Isl1-Myc的质粒（从普法夫博士馈赠）被用作使用快速耦合转录/翻译系统的兔网织红细胞裂解试剂（Promega）中体外ISL-1-Myc的翻译的模板。 DNA结合反应（20mu;l网络最终卷）收录的在体外1mu;l翻译的蛋白或10微克INS-1的beta;细胞行核提取物（24-26）和400纳摩尔32P-末端标记寡核苷酸探针。该寡核苷酸序列如下：MafA的Isl-1野生型，-7,822-CGTAACGTTA ATGGAAGATGCTTGCTGCAG-7793,和MafA的和ISL-1突变体，5-GCCGTAACGTGCCGGGAAGATGCT-3，与突变下划线。反应被允许在30℃下进行20分钟，在含有10毫摩尔/升HEPES（pH值7.8），75毫摩尔/升氯化钾，2.5毫摩尔/升氯化镁，0.1毫摩尔/升EDTA，1毫摩尔/升二硫苏糖醇的缓冲液，3％（体积/体积）聚蔗糖，1mg / ml的BSA和1微克的聚（DI-DC）。竞争实验使用100倍摩尔过量的未标记的野生型或突变的单核苷酸来进行。使用与ISL-1蛋白质或核提取物在室温下搅拌20预温育4 ISL-1-特定音响Ccedil;抗体（发育研究杂交瘤细胞银行，39.3F7，39.4D5，40.2D6和40.3A4）的鸡尾酒中进行抗体超迁移分析前加入0.5在150V的DNA探针。反应在6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并在150V2小时，在0.5*三 - 硼酸盐EDTA缓冲液。凝胶干燥并通过放射自显影。

瞬时转染：调查分析,使用Lipofectamine试剂（Invitrogen）用1培养TC3细胞转染克MafA的区3：PTK（野生型和ISL-1突变）或PTK（安）氯霉素乙酰转移酶（CAT）载体和1mu;g Rous肉瘤的病毒enhancer-驱动的荧光素酶（PRSV - 吕克）。如所述（31），用于MafA的转染报告构建体。定点诱变（QuickChange快速诱变试剂盒，Stratagene）中用于创建在Isl-1结合位点的非互补的颠换突变5-CACGGCCGTAACGTGCCGGGAAGATGCT TGCTGC-3 （突变下划线）。转染后48小时，制备细胞裂解物，和荧光素酶（LUC）（Promega）中并进行CAT（32）测定。 CAT值进行标准化到LUC内部对照。每个实验一式三份与至少两个独立分离的质粒制剂进行。

染色质免疫沉淀。beta;TC3细胞在4*10⁶每10-cm培养皿培育72小时，然后分离并用1％的甲醛在DMEM在室温下5分钟交联的。蛋白质的DNA染色质片段通过超声处理制备，并在4℃下用蛋白A琼脂糖/鲑鱼精子DNA（Millipore公司，加州Temecula）预清除2小时。预清除染色，然后在4℃下用ISL-1单克隆抗体的混合液保温过夜（发育研究杂交瘤细胞银行39.4D5，39.3F7，40.3A4，40.2D6）或作为对照，正常小鼠免疫球蛋白（圣克鲁斯生物技术），或者没有抗体。抗体结合的染色质复合物在4℃与蛋白A琼脂糖珠沉淀4小时。水洗复合物从逆转珠和交联洗脱。定量实时PCR是对使用SYBR绿PCR脑膜混合物（应用生物科学）的Isl-1免疫沉淀的DNA并在ABI棱镜7900仪器1:20进行。△输入DNA的稀释液被用来产生标准曲线和标准化的目的基因（△CT）的放大器阳离子。目标控制序列中的染色质免疫沉淀的DNA（n=3-4）的富集然后计算相对于设定为单一（△△CT）无活性磷酸羧（PEPCK）启动子。非定量PCR反应使用带有Taq DNA聚合酶热启动预混液（5总理，马里兰州盖瑟斯堡）和1

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