从红豆杉中分离出的一种内生真菌有望生产紫杉醇外文翻译资料

《生物科学与生物工程学报》第110卷第5期，541-546页，2010年

“从红豆杉中分离出的一种内生真菌有望生产紫杉醇

Rangarajulu Senthil Kumaran,^1,⁎ Hyung Joo Kim,¹ and Byung-Ki Hur²

韩国国立大学微生物工程学院，首尔143701；韩国仁河大学生物工程学院工业生物技术研究所，仁川402751；韩国仁川南谷永运洞253号

2010年1月29日收到；接受于2010年6月15日；于2010年7月15日上线

摘要：从日本红豆杉的健康叶片和树皮中分离出内生真菌花斑癣和忽略型花斑癣。通过对真菌的特征培养、病原学和分子筛分析，对其进行了鉴定。第一部分，对供试真菌进行了筛选，以期在变性液体中生产紫杉醇。用高效液相色谱、核磁共振氢谱和液相色谱-质谱分析方法证实紫杉醇的存在。P.versicolor产量记录为478mu;g/L，产量是先前报道的真菌（Taxomyces andreane）培养液的9560倍。提取的真菌紫杉醇经细胞凋亡试验表明，紫杉醇浓度的增加可导致细胞死亡。一个基于聚合酶链反应（PCR）的TS筛选，是紫杉醇骨架第四代的一个独特基因，揭示了紫杉醇生物合成的分子结构蓝图。结果表明，P.versicolor是紫杉醇替代供应源的一个很好的候选者，也可以作为一个潜在的遗传工程物种，将紫杉醇的产量提高到一个更高的水平。

copy;2010年，日本生物技术学会版权所有。

[关键词：分析方法；抗癌药物；细胞毒性试验；内生真菌；18SrRNA；花斑松；忽略松；紫杉烯合成酶；紫杉醇生产]

紫杉醇是一种功能化程度很高的抗癌药物，也是世界上第一种价值10亿美元的抗癌药物，最早于20世纪60年代初从太平洋紫杉树中分离出来，1992年美国食品药品监督管理局批准该药用于治疗卵巢癌。它还显示了它对肺癌、乳腺癌、头颈癌以及晚期卡波西肉瘤（艾滋病患者）的作用。紫杉醇（有丝分裂抑制剂）具有独特的作用机制，包括细胞分裂过程中微管的破裂（1）。紫杉醇除了临床应用外，还被广泛应用于生物和生物医学研究，作为微管稳定剂。

紫杉醇在紫杉属植物的针叶、树皮和根中含量极低。这导致了从树木中寻找紫杉醇的新来源，并分离出一种内生真菌，即在紫杉树的内树皮中定居的紫杉醇和其他紫杉醇，这种紫杉醇和其他紫杉醇在半干旱条件下生长时能够产生合成介质（2）。

从红豆杉属分离出的内生真菌种类多样性也被报道产生紫杉醇（3，4）。在过去的18年里，人们对从紫杉和其他一些植物中分离出的内生真菌有着极大的兴趣。到目前为止，有大约30种植物被分离出来，用于生产紫杉醇。然而，从植物材料中分离内生真菌是一个相对简单的过程，但对紫杉醇产生的内生真菌的检测却十分困难（5）。作为一种替代方法，编码紫杉醇生物合成酶的基因被用作筛选紫杉醇内生真菌的分子标记。在本研究中，我们利用编码TS的基因作为分子标记来筛选产生紫杉醇的真菌内生植物。

在本研究中，我们发现了鼠疫菌的种类是从紫杉寄主中分离出的最常见、最具优势的内生真菌。早期文献指出，从植物中分离出的鼠疫菌的内生种显示出不同的生物活性代谢产物（6）。然而，从小孢子虫（7，8）和古皮尼虫（9）中报告的紫杉醇产量很少（单位：纳克）。本研究首次尝试从内生真菌、花斑松和鼠疫菌中筛选紫杉醇。此外，还筛选了真菌紫杉醇对人癌细胞株的细胞毒性。

材料和方法

真菌分离、培养和鉴定 虎杖健康叶片和内树皮的真菌分离、培养和鉴定。以及ZUCC（日本紫杉）是从韩国的康沃尔多森林地区采集的。将其储存在无菌聚乙烯袋中，并在收集后24小时内进行处理。采用标准方法从植物材料中分离培养内生真菌（10）。在分离出的真菌中，云杉（紫杉皮）和忽略木（叶）是最常见的菌种。利用Nikon Coolpix900数码相机，利用Nikon光学三眼显微镜（明亮视野）拍摄真菌的显微照片。通过形态和分子分析，确定了分离出的内生真菌云芝和忽略不计。用聚合酶链反应（PCR）对分离株的18S核糖体RNA序列进行了分析。采用标准方法（11）进行DNA提取、PCR扩增和测序。利用基因库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）的核苷酸爆破技术，将所得的内生真菌的rRNA序列与NCBI中的数据进行比较，以估计可获得的内生真菌之间的相似性百分比。这些真菌被存放在印度国立大学的BSL培养收集室（P.Versicolor BSL No.038；P.Ignora BSL No.045）。

紫杉醇提取 每种真菌都生长在一个3-L的锥形烧瓶中，烧瓶内装有1000毫升化学改性液体培养基M1D，并辅以大豆酮（12）。用早期报道的方法（13）概述了真菌接种、生长、培养条件和紫杉醇提取（胞外）的过程。用于分析的溶剂为高效液相色谱级，用于参考目的的标准紫杉醇（紫杉醇）购自Sigma（美国密苏里州圣路易斯）。

高效液相色谱、液相色谱-质谱和核磁共振氢谱分析 使用C18反相柱（Alltech Econosil，Deerfield，IL，USA；250 m mtimes;4.4 m mtimes;10mu;m）对杨林仪器进行了高效液相色谱研究，流动相由甲醇/水（80:20）组成，流速为1 m l/min。每个10mu;l的样品都是借助于一个微型仪器进行注射的。伊林格在254 nm的紫外光谱上记录峰和保留时间的记录。以高效液相色谱法为基础，通过样品峰面积与紫杉醇标准品峰面积的比较，对真菌紫杉醇进行了定量分析。对溶于甲醇/水（9:1 v/v）中的样品进行了液相色谱-质谱分析。每个样品在VALIAN LC/MS1200 L单次四极质谱仪中注入，喷雾流量为2mu;L/min，喷雾电压为2.2千伏。这个为了证实紫杉醇的存在，还进行了核磁共振氢谱分析。在23°C下使用瓦里安单位Inova光谱仪（在400兆赫下工作，16次扫描，298个实点）。用溶于CDCl3（Sigma）中的样品进行分析。通过与相关化合物的化学位移和耦合常数的比较，确定了质子谱。化学位移报告为相对于TMS的delta;值，作为内部参考，耦合常数报告为赫兹。

细胞毒性试验 用体外细胞凋亡法（14）测定了从云芝和忽略紫杉醇培养滤液中分离出的真菌紫杉醇在不同浓度下对不同癌细胞的细胞毒性作用。本研究中使用的人类癌症细胞系（bt 220、hl 251和hlk 210）购自印度普纳的NCC。用0.005mu;m~5mu;m不同浓度的真菌紫杉醇处理癌细胞，培养48小时，用0.5 mg/ml碘化丙啶在PBS中染色（DNA染色）15分钟，在PBS溶液中染色。用不同浓度的真菌紫杉醇处理后，用光学显微镜观察细胞形态。共有五个不同的区域被随机选择来计数至少500个细胞。计算每个实验的凋亡细胞百分比。被称为凋亡的细胞是那些表现出细胞凋亡特征的细胞，包括细胞体积收缩、染色质凝聚和膜结合凋亡体的存在。每项实验中，500个细胞被计数。所有显示的细胞毒性数据是至少三个独立实验的平均值。凋亡细胞数除以细胞总数times;100，计算凋亡细胞在凋亡中的百分比。

紫杉醇产生菌的标记：真菌DNA的提取和PCR扩增 将从活跃生长菌丝边缘获得的每个分离物的2个琼脂塞（直径5-mm）圆盘接种到含有20 ml pd肉汤培养基的150 ml锥形烧瓶中。将培养物置于120转/分、24plusmn;2°C的旋转摇床上培养5天，5000times;g离心10分钟，水洗两次后，用3000times;g离心15分钟，用预冷的研钵和研杵将1克菌丝碾成液氮粉末。采用标准方法（5）提取真菌DNA并进行PCR扩增。随后，利用聚合酶链反应（pcr）扩增技术筛选产紫杉醇真菌，根据TS基因的保守序列（genbank编号AY364469），设计合成了特异性引物TS-F（5′-CAAACCAACCAACCAAGTCGAATTGAGAAG-3′）和TSR（5′

-CAAGTTTGCATCATCTGGAATCT-3′）。PCR扩增在热循环（TeGEGEN）中进行32次（94°C，60 s，55°C，30 s，72°C 60 s），72℃延长5分钟。PCR产物用凝胶提取微型试剂盒（QIAGEN）纯化，连接到PMD18-T载体（TakaaBieTea技术，韩国），转化为大肠杆菌菌株。然后用Dh5直接Dgtp测序试剂盒（Amersham Biosciences，UK）和373a DNA测序仪进行测序。

结果和讨论

真菌鉴定：形态和分子分析 鼠疫菌是一种常见的植物病原性体腔真菌，据报道可引起与自然界中的农业、园艺和森林植物有关的疾病（15）。在目前的研究中，真菌被记录在培养物中，作为一种最常见和最常见的内生形式从寄主植物材料中分离出来。在PDA中菌落生长良好，在8-12天的培养中获得良好的孢子（图1）。对分离出的内生真菌进行了鉴定，并对其培养形态、分生孢子特征和分子分析进行了分析。

在杂色葡萄球菌（Speg.）Steyaert中，培养皿上的菌落呈现出白色、橙色（在培养皿的背面），蓬松的纹理和带有流苏状边缘的凸起。在PDA培养基中，菌落生长速率约为10-12 mm/天。分生孢子为5细胞孢子，大小约26-32times;6.8-9.2mu;m，纺锤形狭窄，基部逐渐变细。分生孢子的三个中间细胞呈杂色，两个上部细胞呈灰黑色，通常不透明，最低的细胞为橄榄褐色。三个顶端附属物是透明的，长20-35mu;m，有一个短而直的基部花梗（图1a）。此外，18S核糖体RNA基因具有542bp的片段，该片段是从云芝菌株BSL038的DNA中扩增出来的。该序列与其他内生真菌（花斑菌，GenBank号405298；花斑菌，GenBank号40993）的核苷酸爆炸搜索显示相似。它们关系密切，菌株间的相似率为99%。

在P.Ignora（Thum.）Steyaert中，菌落形态显示出肮脏的白色、浅橙色（在板的背面）、棉质结构、平坦的海拔和流苏状边缘。在pda培养基中，菌落生长速率记录为12-14mm/天。分生孢子为5细胞，狭纺锤形，直或稍弯曲，基部逐渐变细（图1b）。他们测量了大约20-27times;5.7-7.8mu;m，3个顶端的小柱体长15-25mu;m，基部的花梗长7mu;m。在明亮的显微镜下，这些差异是很明显的。此外，18S核糖体RNA基因具有504bp的片段，该片段是从P.Ignora菌株BSL045的DNA中扩增而来。该序列与其他内生真菌（P.Ignora YY8A，GenBank编号EF055213；P.Ignora K9AW，GenBank编号EF055211）的核苷酸爆炸搜索结果相似。结果表明，各菌株之间的相似率为99%。这些菌株之间的密切关系证实了真菌的鉴定。

图1。在明视野显微镜下观察了内生真菌（a）云芝（p.versicolor）和（b）忽略（p.consigna）的无性分生孢子（400倍），分生孢子的大小为20mu;m。各真菌菌落的培养形态显示为插入物。

高效液相色谱分析 高效液相色谱分析结果显示紫杉醇的存在，通过记录保留时间在4.7到4.8分钟之间的峰（图2a-c）。内生真菌云杉在M1D（478mu;g/L）中产生高含量紫杉醇，其次是忽略紫杉醇（375mu;g/L）。在空白培养样品中未观察到紫杉醇的检测，在所有分析中均显示阴性结果。由于真菌紫杉醇的产量较高（以微克计），因此用高效液相色谱分析很容易对其产量进行量化。然而，在先前的报告中，由于产量水平被记录为较低（单位：毫微克；4,9,16），因此通过免疫分析对其进行了量化。利用真菌发酵的最大问题是产量低，紫杉醇生产不稳定。这些真菌的紫杉醇产量从24 ng/l到70 ng/l（2，4）。与寄主相比，红豆杉内生真菌产生的紫杉醇量相对较小，但真菌的产生时间短，生长速度快，有必要对其进行深入的研究。

图2。（a）标准紫杉醇和真菌紫杉醇的高效液相色谱分析。流动相为甲醇/水（80:20，v/v），流速为1.0 ml/min，在254 nm的紫外光谱上记录峰和保留时间。真菌样品的保留时间在4.7到4.8分钟之间，与标准紫杉醇相比，峰值相同。

光谱研究 在1H核磁共振光谱分析中，几乎所有的信号都被很好地分辨出来并分布在1.0到8.0 ppm之间的区域（图3a-c）。甲基和乙酰基引起的三个强质子信号位于1.0到2.5 ppm之间的区域，以及某些亚甲基引起的多峰。紫杉烷骨架和侧链中的大部分质子都在2.5-7.0ppm之间，由c-2′苯甲酸盐、c-3′苯基和c-3′苯甲酰胺基引起的芳香族质子信号出现在7.0-8.0ppm之间。真菌紫杉醇的核磁共振氢谱与标准紫杉醇的核磁共振氢谱一致。紫杉醇的特征化学位移如图3所示。在本次调查中获得的紫杉醇分配也得到了早先的报告（17）的确认。此外，通过LC-MS光谱分析（图4a-c）获得了紫杉醇特性的令人信服的证据。典型地，标准紫杉醇在分子量为854时产生（m h） 峰，在分子量为876时产生（m na） 峰。相比之下，真菌紫杉醇也在m/z 854和m/z 876处产生了峰（m h） 特征片段峰分别为344、367和395。在紫杉醇质谱中观察到的主要片段离子被分为三类，它们代表紫杉醇分子（18）的主要部分。这些峰类似于紫杉醇，表现出与标准紫杉醇（854）的分子离子（M H） 相对应的质量电荷（M/Z）比，证实了紫杉醇在真菌提取物中的存在。很明显，二萜紫杉醇更为复杂，因为它的高分辨率质谱分子量为854，与前面报道的c47h51no14分子式相对应（18）。

细胞毒性评价 用凋亡测定法进一步检测各种人类癌细胞，即。乳腺细胞-BT220，肺细胞-HL251，白血病细胞HLK 210。结果表明，随着紫杉醇浓度从0.005mu;m增加到0.05mu;m，紫杉醇通过凋亡诱导细胞死亡。随着紫杉醇浓度从0.05mu;m进一步升高到0.5mu;m，紫杉醇通过细胞凋亡诱导的细胞死亡仅略有增加。当紫杉醇浓度从0.5mu;m增加到5mu;m时，紫杉醇诱导的细胞凋亡明显减少（表1）。在目前的调查中，据观察，从低到中浓度（0.005到5mu;m），真菌紫杉醇的疗效相对依赖于特定的细胞类型，这与早期报告（19）的结果一致。据报道，低浓度紫杉醇（NM）诱导细胞凋亡，紫杉醇的作

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